Urejanje gena ALOX 15 z metodo CRISPR/Cas9 v celicah HEK293Perčič, Anja (Avtor) Narat, Mojca (Mentor) Lainšček, Duško (Komentor) molekularna biologijaimunologijagenetikagenommodifikacijecelične linijesterilno vnetjelipoksigenazaCRISPRVnetje, ki se pojavi brez prisotnosti mikroorganizmov, se imenuje sterilno vnetje. Obstaja več razredov receptorjev, ki so odgovorni za zaznavanje in sprožitev vnetnih odzivov. To so receptorji za prepoznavanje vzorcev oz. motivov na mikroorganizmih (ang. pattern recognition receptors, PRR). Najbolj znani od teh receptorjev so Toll-u podobni receptorji (TLR). Eden izmed njih je TLR4. V primeru sterilnega vnetja, na aktivacijo posredno vpliva tudi encim 15-lipoksigenaza (ALOX 15). Zunajcelični vezikli se ob stresu sproščajo iz celic. Njihova membrana je sestavljena iz fosfolipidne membrane, katere fosfolipidi so substrat za lipidno peroksidacijo. Peroksidira jih ALOX 15. Tako nastajajo hidro(pero)ksilirani fosfolipidi in se lahko vežejo na kompleks TLR4-MD-2, kar povzroči aktivacijo TLR4. Cilj magistrskega dela je bil narediti celično linijo, v kateri se ALOX 15 ne bi izražal. Odločili smo se, da uporabimo sistem CRISPR/Cas9 za modifikacijo genoma. Načrtovali in pripravili smo konstrukt glede na tarčno zaporedje v genomu, ga vnesli v celice in naredili selekcijo s puromicinom. Genomsko modifikacijo smo preverili s testom T7E1, za nadaljnje delo smo izbrali pet klonov, iz teh izolirali DNA in opravili imunodetekcijo s protitelesi za preverjanje izražanja ALOX 15. Uspešno smo naredili celično linijo z manjšim izražanjem ALOX 15, kar nam omogoča nadaljnje raziskovanje mehanizma aktivacije po tej poti.20192019-12-05 07:45:03Magistrsko delo/naloga113122sl