Vrednotenje citotoksičnih učinkov zaviralcev proteasoma v odvisnosti od izražanja njegovih podenot β5Sever, Ana (Avtor) Gobec, Martina (Mentor) Šmid, Alenka (Komentor) kronična limfocitna levkemijaimunoproteasomzaviralci imunoproteasomaProteasom in imunoproteasom sta pomembna encimska kompleksa v človeškem telesu. Prvi je prisoten v vseh celicah, drugi pa predvsem v celicah imunskega sistema, kjer ima pomembno vlogo v mnogih procesih. Zato je zanimiva tarča pri zdravljenju številnih avtoimunskih bolezni in rakavih obolenj. Med njimi je tudi kronična limfocitna levkemija, ki kljub razvoju in napredku terapije v zadnjih letih še vedno ostaja neozdravljiva. V ta namen se iščejo nove tarče, ki bi lahko vodile v njeno uspešnejše zdravljenje. Med raziskovalnim delom smo najprej opazovali vlogo proteasoma in imunoproteasoma na izoliranih limfocitih B 11 pacientov z diagnosticirano KLL. Spremljali smo in vitro citotoksičnost neselektivnega zaviralca karfilzomiba in dveh selektivnih zaviralcev imunoproteasoma PR-957 in DPLG-3. Citotoksičnost smo merili s testom metabolne aktivnosti po 24 in 48 urah, s čimer smo določili srednjo zaviralno koncentracijo (IC50). Pokazali smo, da so vsi trije zaviralci citotoksični na celice KLL in vitro, vendar vsak v svojem koncentracijskem območju. Najbolj citotoksičen je karfilzomib (IC50=2,95 nM), sledi mu PR-957 (IC50=40,62 nM), najmanj citotoksičen pa je DPLG-3 (IC50=2461 nM). Citotoksičnost je tudi časovno odvisna – po 48 urah so IC50 vrednosti za 85% nižje. V nadaljevanju smo s pomočjo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času določali izražanje genov za podenote proteasoma in imunoproteasoma (β5c, β5i, β2c, β2i, β1c, β1i). Zanimalo nas je predvsem izražanje podenot β5c in β5i, saj se zaviralci, s katerimi smo preverjali citotoksičnost, v različni meri selektivno vežejo na ti dve podenoti. Ugotovili smo, da le eden izmed izbranih vzorcev izraža podenoto β5i bolj kot β5c. Korelacije med citotoksičnostjo zaviralcev in genskim izražanjem posameznih podenot nismo ugotovili. Za konec smo želeli preveriti še izražanje podenot proteasoma in imunoproteasoma na ravni proteinov. Za določanje le-teh smo proteine prenesli na membrano s postopkom western in želene podenote določili s pomočjo specifičnih protiteles. Zanimalo nas je, če gensko izražanje podenot korelira z izražanjem podenot na ravni proteinov. Te povezave nismo ugotovili, zato smo dodatno preverili, če izražanje podenot na ravni proteinov korelira s citotoksičnim učinkom zaviralcev. Tudi te hipoteze nismo mogli potrditi. Statistično značilne korelacije med različnimi parametri nismo uspeli potrditi. Eden izmed razlogov je lahko tudi prenizko število vzorcev, na katerih smo opravljali raziskavo, zato bi bilo v prihodnje potrebno povečati njihov nabor in ponoviti analize.20192019-11-08 08:35:03Magistrsko delo/naloga112727sl