Znotrajcelična porazdelitev in mobilnost proteina Nef virusa HIV-1 v kulturi humanih celic mikroglijeGabrovec, Ana (Avtor) Stenovec, Matjaž (Mentor) Kreft, Marko (Komentor) mikroglijaHIV-1 Nef.GFPlokalizacijamobilnost mešičkovkalcijeva signalizacijaeksocitozaPo okužbi z virusom HIV-1, mikroglija množično proizvaja virusni protein Nef, ki nadalje spodbudi proizvodnjo virusa in poveča njegovo infektivnost. Kljub temu je malo znanega o znotrajcelični porazdelitvi tega proteina, njegovem transportu in izločanju iz mikroglije. V raziskavi smo zato transfecirali imortalizirano mikroglijo človeka s plazmidom za Nef označenim z zelenim fluorescentnim proteinom (Nef.GFP) in optofiziološko raziskali z Nef.GFP-obogatene celične predelke, njihovo mobilnost in izločanje Nef iz mikroglije v kulturi. Z analizo konfokalnih mikrografij smo potrdili, da so Nef.GFP-pozitivne strukture manjše od dekstran-pozitivnih mešičkov in se počasi ter neusmerjeno premikajo v primerjavi s hitro in usmerjeno mobilnimi dekstran-pozitivnimi mešički. Nef.GFP se je neznatno vključil v membrane različnih endosomov vključno z dekstran-pozitivnimi mešički in znatno lokaliziral v membranske predelke imunopozitivne za tetraspanina CD9 (36±4 %) in CD81 (22±1 %). Povečano izražanje virusnega proteina je sovpadalo tudi z zmanjšanjem števila CD9- in CD81-pozitivnih struktur v periplazmalemalnem predelu mikroglije. Z ionomicinom izzvano povečanje citosolne aktivnosti kalcija ni vplivalo na mobilnost Nef.GFP-pozitivnih struktur, a je močno in nepovratno zavrlo mobilnost dekstran-pozitivnih mešičkov. Počasno zmanjšanje števila Nef.GFP-pozitivnih struktur (5±1 struktur/min), ki je indikativno za izločanje Nef iz mikroglije smo opazili le v nedraženih, kontrolnih celicah in ne v celicah draženih z ionomicinom, v katerih se število struktur ni zmanjšalo v času (0±2 strukturi /min; P<0.05). Povečana znorajcelična koncentracija prostih Ca2+ ([Ca2+]i) je tako zavrla in ne spodbudila izločanje Nef.GFP iz celic, kar kaže, da se Nef verjetno izloča z ektosomi po brstenju iz plazmaleme in ne z uravnavano eksocitozo eksosomov iz svetline multivezikularnih telesc mikroglije.20192019-10-31 07:45:43Magistrsko delo/naloga112667sl