Optimizacija priprave rekombinantnega monomernega proteina lizenina in njegovih porŠtromajer, Eva (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) biotehnologijalizeninmonomeri rekombinantni proteinporotvorni proteinkromatografijačiščenje proteinaNi-NTA kromatografijapolihistidinski repektvorba porelipidni dvoslojLizenin je proteinski toksin iz deževnika Eisenia foetida, ki tvori pore v lipidnih membranah. V celici nastaja v monomeri obliki in ob prepoznavanju tarčnih membranskih lipidov, predvsem sfingomielina, tvori najprej predporo iz 9 monomernih enot. Kasneje pride ob večjih konformacijskih spremembah do vsidranja tega oligomera v lipidni dvosloj in nastanka transmembranske pore. Lizeninska pora je zaradi svojih edinstvenih strukturnih, biokemijskih in biofizikalnih lastnosti zanimiva za uporabo v biotehnoloških aplikacijah. Za ta namen je ključno čim bolj učinkovito izražanje in čiščenje rekombinantnega monomernega proteina iz bakterijske celične suspenzije. V nalogi smo izvedli optimizacijo priprave monomerega proteina, vse od priprave ustreznega plazmidnega konstrukta, do postopkov čiščenja monomerega proteina in biološko aktivne pore. Za izboljšanje postopkov čiščenja smo izdelali plazmidni konstrukt za izražanje proteina v bakterijskih celicah, ki ima na C-koncu polihistidinski repek, kar omogoča čiščenje proteina z afinitetno kromatografijo. Položaj afinitetnega repka na C-koncu se je tekom poskusa izkazal za izboljšavo v primerjavi s položajem repka na N-koncu lizenina, saj smo na ta način iz suspenzije pridobili dvakrat večjo količino čistega proteina. Po izolaciji in čiščenju monomera smo porotvorno aktivnost lizenina preverili s testom hemolize, pravilnost zvitja pa smo preverili z merjenjem spektra cirkularnega dikroizma. Iz monomerov lizenina smo tudi pripravili pore na umetnih sistemih lipidnih membran, jih tudi izolirali in očistili.[E. Štromajer]20192019-10-31 07:45:37Magistrsko delo/naloga112666sl