Pridobivanje ksilanaze iz družine GH10 iz metagenoma komposta in ugotavljanje njenih lastnostiJamnik, Mojca (Avtor) Vodovnik, Maša (Mentor) encimimetagenom kompostaglikozid hidrolazaGH10ksilanazaksilanheterologno izražanje encimovUporaba fosilnih goriv je zaradi sproščanja toplogrednih plinov vse večji okoljevarstveni problem, zato je pomembno iskanje novih, trajnostnih in okolju prijaznejših virov energije. Biogoriva druge generacije imajo velik potencial za razvoj trajnostne ekonomije. Pridobivajo jih z razgradnjo in fermentacijo lignocelulozne biomase, ki je najbolj razširjen in cenovno ugoden obnovljiv substrat. Za razvoj proizvodnje biogoriv je ključno iskanje novih encimov za razgradnjo biomase, saj ti zaenkrat zaradi visoke cene, premajhne učinkovitosti in slabe stabilnosti v procesnih razmerah še ne dosegajo povpraševanja. V magistrski nalogi smo v metagenomski DNA komposta identificirali ksilanazo iz družine GH10 z dvema vezavnima domenama za ogljikove hidrate (CBM). Tarčni gen (xylM_3) smo prenesli v ekspresijski sev in analizirali izražanje produkta pri različnih pogojih. Ugotovili smo, da se produkt tarčnega gena optimalno izraža ob dodatku 0,75 mM IPTG, največ aktivnega encima pa dobimo po 20-urni inkubaciji pri 18 °C. Tarčni encim smo poskušali očistiti z afinitetno kromatografijo (Ni-NTA) v nativnih in denaturirajočih pogojih, vendar izoliranega nismo uspeli pridobiti v aktivni obliki. Kljub vsemu smo z analizo encimskih frakcij ugotovili, da je encimski ekstrakt aktiven v temperaturnem območju med 20 in 60 °C in pri pH 5-8, najvišjo aktivnost pa dosega pri temperaturi 50 °C in pH = 6. Pokazali smo tudi, da encimski ekstrakt lahko razgrajuje bukov ksilan in arabinoksilan. Aktivnost encimskega ekstrakta na ksilanu se je povečala ob dodatku 1, 5 in 10 mM K+ in 1 mM Co2+ ter 0,2 mM detergenta Triton-X 100. Ob dodatku ostalih testiranih ionov in kemikalij nismo ugotovili sprememb v encimski aktivnosti ali pa se je ta znižala.[M. Jamnik]20192019-10-03 07:45:27Magistrsko delo/naloga111549sl