Razvoj orodij za genetsko manipulacijo sevov rodu PrevotellaGrkman, Petra (Avtor) Accetto, Tomaž (Mentor) prevotelegenetska manipulacijaPrevotella bryantii TC1-1restrikcijske endonukleaze tipa IIcelični ekstraktin vitro zaščitaelektrotransformacijaizražanje proteinaBakterije rodu Prevotella so po Gramu negativni, nesporogeni in anaerobni mikroorganizmi, ki so del prebavne ter ustne mikrobiote živali in ljudi. Vrste so izolirane iz ustne votline sesalcev, iz vampa prežvekovalcev, debelega črevesa, urogenitalnega trakta in kliničnih vzorcev. Vampne prevotele predstavljajo največji delež po Gramu negativnih bakterij v populaciji in prispevajo k razgradnji polisaharidov v rastlinski celični steni in metabolizmu proteinov. Orodja za genetsko manipulacijo prevotel so maloštevilna, prav tako ni na voljo orodja za tarčno inaktivacijo genov. Poznamo samo en sprejemni sev Prevotella bryantii TC1-1, za katerega je na voljo plazmidni vektor, ki nam omogoča kontrolirano izražanje genov. Za vnos v ta sev prenosljivi vektor pRH3 najprej in vitro zaščitimo pred restrikcijskimi endonukleazami in ga vnesemo v sev z elektroporacijo. Na enak način smo poskušali elektrotransformirati še tri druge seve P. bryantii in P. brevis, vendar nam ni uspelo, saj imajo sevi izraženo močno nespecifično nukleazno aktivnost. Nadeljevali smo z ugotavljanjem optimalnih pogojev elektrotransformacije P. bryantii TC1-1 in ugotovili najbolj primerne pogoje zaščite in elektroporacije. Z vnosom gena za metilazo PbrTI (locus_tag CIK91_RS00145) iz P. bryantii v sev TC1-1 smo želeli izboljšati metodo zaščite DNK s celičnim ekstraktom, a zaščita ni bila boljša. Z izolacijo proteina z afinitetno Ni-NTA kromatografijo smo želeli nadomestiti pripravo celičnega ekstrakta. Učinkovitost zaščite DNK z izoliranim proteinom prav tako ni bila uspešna, saj je med njegovo izolacijo potekla proteoliza.[P. Grkman]20192019-10-02 07:45:37Magistrsko delo/naloga111502sl