Optimizacija aktivacije prokatepsina L in vitroHauptman, Nastja (Avtor) Pečar Fonović, Urša (Mentor) Katepsin LaktivacijaPeptidaze so encimi, ki katalizirajo cepitev peptidne vezi v polipeptidni verigi in tako omogočajo razgradnjo proteinov do manjših peptidov ali do aminokislinskih preostankov. Prisotne so v vseh živih organizmih in so vključene tako v fiziološke kot v patološke procese. V medicini predstavljajo zaradi svoje regulatorne vloge ter udeleženosti pri patoloških procesih potencialne tarče za zdravljenje. Med najbolj poznane človeške cisteinske peptidaze spadajo katepsini, ki se v aktivni obliki največkrat nahajajo v lizosomih. Katepsin L je široko izražena lizosomska peptidaza, ki je vključena v mnogo različnih celičnih funkcij. Pomembno vlogo ima pri znotrajceličnem obnavljanju proteinov, epidermalni homeostazi, pri predstavitvi antigenov ter tudi pri razvoju las. Prav tako pa je katepsin L nadpovprečno izražen v maligno spremenjenjih celicah. Povečano je izražen pri raku jajčnikov, dojk, prostate, pljuč, želodca, trebušne slinavke in debelega črevesa. Motnje v njegovi aktivnosti vodijo tudi do hudih nepravilnosti v razvoju kože, las in kosti. Tako ima kontrola izražanja katepsina L in uravnavanje njegove aktivnosti zdravilen učinek na mnoga bolezenska stanja. Tekom diplomskega dela smo optimizirali pogoje za avtoaktivacijo prokatepsina L s spreminjanjem temperature, različnih načinov inkubacije (inkubator, vodna kopel) in časa aktivacije. Izvedli smo štiri avtoaktivacije in rezultate pridobili z elektroforezo, v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata in prenosom western, s katerim smo razlikovali med neaktivno in aktivno obliko katepsina L. Aktivnost katepsina L po avtoaktivaciji smo merili preko razgradnje fluorogenega substrata Z-FR-AMC. Meritve so pokazale, da je do največje aktivacije prišlo pri vzorcih, ki so bili inkubirani na 37 °C, v vodni kopeli 60 in 90 minut. Do nizke izmerjene aktivnosti je prišlo pri tretji aktivaciji, kjer smo aktivirali večji volumen. Pri ponovni aktivaciji manjšega volumna tretje aktivacije, je prišlo do popolne razgradnje encima.20192019-10-01 08:35:04Diplomsko delo/naloga111439sl