Priprava in strukturna karakterizacija tumorskega označevalca Trop2 z uporabo delno glikoziliranih mutiranih oblikVidmar, Jernej (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) Trop2kristalizacijaX-raystrukturaEpCAMTrop2 je transmembranski glikoprotein, ki se pogosto povečano izraža na površini rakastih celic epitelijskih tkiv. Vključen je v celično signaliziranje, katerega začetna stopnja je njegova proteolitska cepitev, sprožitev in pa natančen potek pa še ni popolnoma razjasnjen. Končni učinek prenosa signala vodi k povečani proliferaciji. V okviru magistrskega dela smo želeli podrobneje strukturno okarakterizirati Trop2 in sicer preko določitve kristalne strukture njegovega zunajceličnega dela (Trop2EX). Pripravili smo delno glikozilirane mutirane oblike Trop2EX, da bi z zmanjšanim obsegom heterogene glikozilacije dobili kemijsko bolj homogen vzorec. V luči tega smo z ugasnitvijo izbranih glikozilacijskih mest pripravili štiri delno glikozilirane oblike Trop2EX in se po meritvah DLS odločili za eno izmed njih (Trop2EX(1X3X)). Gre za obliko Trop2EX, ki ima mutirani drugo in četrto glikozilacijsko mesto (mutaciji N120Q in N208Q). Protein smo očistili, končen vzorec pa je vseboval dve različno glikozilirani obliki Trop2EX. Z analizo proteolitske stabilnosti smo pokazali, da naš vzorec ne vsebuje zaznavnih količin kontaminirajočih proteaz, ki bi lahko cepile izpostavljene regije polipeptidne verige in negativno vplivale na integriteto proteina. Izvedli smo presejalne kristalizacijske teste ter identificirali osnovne kristalizacijske pogoje, ki smo jih optimirali z namenom doseganja boljše difrakcijske kvalitete. Ločljivost, do katere sipajo kristali, smo želeli izboljšati tudi s post-kristalizacijsko obdelavo in sicer preko kontrolirane dehidracije kristalov. Najboljše kristale, ki so sipali do ločljivosti 2,8 Å, smo dobili z uporabo kristalizacijskega aditiva EDTA. Prostorska skupina je P 43 2 2. Fazni problem smo rešili z molekulsko zamenjavo z uporabo znane strukture EpCAM (zunajcelični del – EpEX). Ugotovili smo, da so v asimetrični enoti 4 molekule oz. podenote, ki tvorijo dva dimera. Strukturo Trop2EX smo delno rešili in izpilili; nekatere regije je potrebno ponovno zgraditi, za nekatere pa je elektronska gostota trenutno tako slaba, da njihove strukture ne moremo zgraditi. S primerjavo te strukture s strukturo EpEX smo ugotovili, da sta si strukturi relativno podobni (RMSD poravnanih atomov Cα = 1,94 Å), a v nekaterih regijah so prisotne določene razlike, še posebej v orientaciji N-končne domene glede na preostali del molekule. Ob tem je vzorec disulfidnih vezi v N-končni domeni identičen pri obeh proteinih, isto velja tudi za tiroglobulinsko domeno. Za dimerizacijo so ključne interakcije med aminokislinskimi ostanki β-ploskve in največje zanke tiroglobulinske domene, pri tem pa gre v največji meri za solne mostičke; podobno velja tudi za dimer EpEX. Delno rešena struktura je dobra osnova za končno celotno strukturo zunajceličnega dela Trop2.20192019-09-30 11:55:06Magistrsko delo/naloga111412sl