Izražanje in karakterizacija nekaterih mutantnih oblik človeškega katepsina SCirnski, Ana (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) katepsin Skatepsin KmutantaalosterijainhibitorKatepsin S je papainu podobna cisteinska proteaza. Najbolj se izraža v poklicnih antigen predstavitvenih celicah, kot so dendritične celice, makrofagi in limfociti B, kjer ima pomembno vlogo pri procesiranju in predstavitvi antigenov. Tako kot ostali cisteinski katepsini se nahaja v lizosomu, kjer je reducirajoče okolje in nizek pH, ki je potreben za njihovo delovanje. Za razliko od ostalih je katepsin S stabilen tudi pri višjem pH, zato je lahko dlje časa aktiven tudi v izvenceličnem prostoru. Evolucijsko najbolj soroden mu je katepsin K, ki se izraža v različnih tkivih, največ pa v osteoklastih, kjer ima pomembno vlogo pri preoblikovanju kosti. Izloča se v kislo okolje resorpcijske lakune, kjer cepi trojno vijačnico kolagena I. Prekomerna aktivnost je povezana s številnimi boleznimi, med drugim z osteoporozo. V zadnjih letih se čedalje več pozornosti namenja razvoju alosteričnih inhibitorjev proteaz, saj v nasprotju z ortosteričnimi inhibitorji, ki se vežejo v aktivno mesto, le delno inhibirajo aktivnost proteaz in so zato bolj primerni za daljše terapije. Namen magistrskega dela je bil določiti mehanizme delovanja nekaterih že znanih (alosteričnih) inhibitorjev katepsina K na izbrane mutante katepsina S in s tem preveriti njihovo vezavo na izbrano alosterično moesto ter pomen posameznega zamenjanega aminokislinskega ostanka za vezavo teh inhibitorjev. Na podlagi strukturne primerjave obeh encimov smo z mestno specifično mutagenezo pripravili izbrane mutantne oblike človeškega katepsina S, kjer so bili zamenjani aminokislinski ostanki identični ujemajočim se ostankom v alosteričnem mestu katepsina K. S testiranjem kinetičnih parametrov potencialnih alosteričnih inhibitorjev smo določili mehanizme njihovega delovanja na posamezne mutante. Pokazali smo, da spojine 2-[2-(dietilamino)acetamido]benzojska kislina, metil (R)-(2,5-dioksopirolidin-3-il)glicinat in 2-benzilmalonska kislina delujejo na izbrane mutantne oblike katepsina S kot alosterični efektorji in da se najverjetneje vežejo v preučevano mesto. Pri vseh mutantah pride v prisotnosti teh spojin do bolj učinkovite inhibicije encimske aktivnosti v primerjavi z divjim tipom katepsina S, vendar ne moremo z gotovostjo trditi, kakšno vlogo imajo posamezni aminokislinski ostanki za vezavo alosteričnih modifikatorjev na testirane encime.20192019-09-25 10:35:08Magistrsko delo/naloga111168sl