Ločevanje izooblik monoklonskih protiteles z lektiniKosmač, Gašper (Avtor) Podgornik, Aleš (Mentor) monoklonska protitelesaizključitvena kromatografijalektiniglikozilacijaPreučevali smo interakcijo monoklonskih protiteles (mAb) z lektinom konkanavalinom A (ConA) v raztopini, ter pogoje, pri katerih vezava med proteinoma optimalno poteče. Z merjenjem intrinzične fluorescence triptofana, smo preučevali razvijanje strukturne konformacije mAb, ob spreminjanju parametrov kot so pH pufra, temperatura inkubiranja, ter dolžina časa inkubacije. Na podlagi teh meritev smo jim določili talilno temperaturo (Tm), ki je znašala 61 °C, ter denaturacijski čas (tm), ki je znašal približno 60 minut. Z metodo izključitvene kromatografije smo preučevali nastanek agregatov, ter tvorbo morebitne povezave med mAb in ConA. Povezave med proteinoma nismo zaznali. Z namenom popolne izpostavitve glikozidnih ostankov na mAb, smo le tem dodali reagent DTT, vendar do redukcije disulfidnih vezi, ter razcepitve verig mAb verjetno ni prišlo. Sklepali smo, da bi lahko bil vzrok tvorbe agregatov, ob sočasni izgubi nativne oblike, ter odsotnosti razcepitve mAb ob dodatku DTT, oksidativni učinek le tega na mAb. Učinek bi lahko sprožila povišana temperatura pri inkubaciji mAb. Verjetno predhodno oksidiranost, ter posledično neustreznost reagenta DTT smo pokazali tudi z detekcijo le tega pri 280 nm. Poskusili smo tudi z vezavo dekstrana, ter glikoziliranega BSA na ConA. V nobenem primeru vezave nismo zaznali. Z izključitveno kromatografijo smo ugotovili, da se uporabljani ConA neodvisno od okolja nahaja v monomerni obliki, ki je biološko neaktivna.[G. Kosmač]20192019-09-22 07:47:11Magistrsko delo/naloga111063sl