LOGIČNA VEZJA NA OSNOVI RAZCEPLJENIH ORTOGONALNIH PROTEAZFink, Tina (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) logična vezjaortogonalne razcepljene proteazeobvite vijačniceS sintezno biologijo in implementacijo logičnih vezij v žive organizme se je začelo tako imenovano biološko računalništvo. Sprva v bakterijah, kjer so že leta 2000 v E. coli pripravili prva kompleksna sintetična logična vezja na osnovi regulacije prepisovanja genov. Do danes so pripravili že več različnih celičnih vezij tako v bakterijah, kvasovkah kot tudi v sesalskih celicah. Večinoma vsa vezja temeljijo na uravnavanju prepisovanja genov, kar je sicer lažje načrtovati, vendar je odzivni čas takšnih celičnih vezij relativno počasen in ni primeren za aplikacije, ki zahtevajo odziv na spremembe v okolju v nekaj minutah. Zato ni presenetljivo, da je velik izziv sintezne biologije predstavljalo prav povečanje hitrosti procesiranja informacij v celicah. Signalno pot smo zasnovali na proteinskih interakcijah z obvitimi vijačnicami ter modifikacijah proteinov s proteolizo in se s tem izognili dolgotrajnejšim procesom prepisovanja in prevajanja genov. Pripravili smo nabor ortogonalnih razcepljenih proteaz, katerih aktivnost smo nadzorovali z zunanjimi signali, ter nabor obvitih vijačnic z avtoinhibitorno domeno. Z uvedbo cepitvenih mest za proteaze v zanki med antiparalelnima dimeroma ter v povezovalnem segmentu med segmentom obvite vijačnice ter funkcionalno domeno je dimerizacija obvitih vijačnic postala odvisna od proteolize, kar nam je omogočilo izvedbo vseh dvovhodnih Boolovih logičnih operacij v sesalskih celicah. V sesalskih celicah smo pokazali, da se celice s takšno signalno potjo lahko na zunanje signale odzovejo že po 15 minutah, kar je bistveno hitreje od tega kar zmorejo dosedanji sistemi. S primerjavo uravnavanja prepisovanja genov in aktivacije s proteolizo smo pokazali, da signalna pot na osnovi uravnavanja prepisovanja genov za primerljiv odziv potrebuje vsaj 2 uri. Poleg hitrosti je pomembna lastnost tega sistema tudi možnost združevanja reakcij v vzporedne in verižne reakcije ter kaskade. Z izvedbo proteaznega inverterja ter tristopenjske proteazne kaskade smo pokazali tudi modularnost in razširljivost signalne poti. Z uvedbo dodatnih proteaz, kot je proteaza HIV-1, ter s prenosom signalne poti v druge celične linije smo pokazali, da je zasnovana signalna pot robustna in neodvisna od endogenih celičnih procesov.20192019-09-15 07:15:38Doktorsko delo/naloga110455sl