Optimizacija ligacije inteinskih konstruktov za pripravo segmentno označenega α-aktinina-1Cafun, Ajda (Avtor) Djinović Carugo, Kristina (Mentor) α-aktinin-1aktin-vezavna domenaNMR spektroskopijasegmentno izotopsko označevanjePTSα-aktinin-1 je aktin-vezavni protein, ki na območju stresnih vlaknih in fokalnih stikov prečno povezuje aktinske filamente ter jih pripenja na membranske adhezijske komplekse. S tem opravlja pomembno vlogo pri procesu celičnega premikanja. Njegova funkcija povezovanja aktinskih filamentov je negativno regulirana s povišano znotrajcelično koncentracijo kalcija. Vezava kalcijevega iona v kalmodulinu podobno domeno človeškega α-aktinina-1 povzroči konformacijske spremembe, ki vplivajo na dinamiko priležne aktin-vezavne domene (ABD). Natančnejši mehanizem regulacije in z njim povezane konformacijske spremembe še niso pojasnjeni, zato smo želeli okarakterizirati spremembe v dinamiki domene ABD med apo (z vezanim Ca2+-ionom) in holo (brez vezanega Ca2+-iona) oblikama α-aktinina-1 z metodo NMR. Ker je celoten α-aktinin-1 prevelik za preučevanje z NMR, želimo za nadaljnje raziskave pripraviti segmentno označen protein, pri katerem bo izotopsko označena zgolj domena ABD. Pripravo segmentno označenega proteina omogoča ligacija dveh ločeno izraženih fragmentov željenega proteina z metodo trans-spajanja preko razcepljenega inteina. V tem delu smo postavili izhodišče za pripravo segmentno označenega α-aktinina-1. Uspešno smo izolirali inteinska konstrukta z zapisom za fragmenta α-aktinina-1 in ju ligirali z metodo trans-spajanja preko razcepljenega inteina Cfa. Ligacijo inteinskih konstruktov smo optimizirali in pokazali, da je izkoristek ligacije največji pri temperaturi 33 °C. Z ligacijo inteinskih konstruktov v velikemmerilu smo potrdili, da je izkoristek ligacije dovolj velik za pripravo segmentno označenega α-aktinina-1 za meritve NMR.20192019-09-10 14:00:10Diplomsko delo/naloga109937sl