Vpliv nanotelesa M33 na celično smrt povzročeno s proteinom MLKLČerne, Urška (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) nekroptozaMLKLfluorescenčno nanotelomCherryPsevdokinaza MLKL je pomembna molekula pri procesu nekroptoze, oblike programirane celične smrti z morfološkimi značilnostmi nekroze. Nekroptoza privede do naluknjanja celične membrane in izlitja celične vsebine v okolico sosednjih celic, kar sproži vnetni odziv. Povezujejo jo s številnimi človeškimi vnetnimi boleznimi. Protein MLKL oligomerizira in se prestavi na celično membrano, kjer povzroči celično smrt. Fluorescenčna nanotelesa predstavljajo pomembno orodje za vizualizacijo mnogih antigenov znotraj žive celice. Razvita so bila številna nanotelesa proti proteinom, ki sodelujejo pri vnetju in s tem vplivajo na imunski odziv. V sklopu magistrske naloge smo potrdili vezavo proteina MLKL in fuzijskega nanotelesa M33-mCherry s kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Nanotelo M33 se veže na N-končni del proteina MLKL (MLKLN-154). Detekcija proteina MLKL, ki se po predhodni transfekciji izraža v celicah HEK293T, s fuzijskim nanotelesom M33-mCherry ni bila uspešna. Določali smo kolokalizacijo proteinov M33 in MLKLN-154 v celicah HEK293T po predhodni transfekciji z obema konstruktoma. Kolokalizacijo smo opazovali na celični membrani, kamor se translocira protein MLKL za sprožitev celične smrti. Protein MLKLN-154 ne sproži celične smrti in se nahaja v citoplazmi. Mutirana oblika MLKLN-154 D144K povzroči celično smrt, torej se translocira na membrano in je zato primerna za opazovanje kolokalizacije. Določili smo, kdaj se mutiran protein začne izražati, vendar še ne sproži celične smrti. Potrdili smo tudi izražanje fuzijskega proteina M33-mCherry. Kljub temu nismo uspeli zaznati kolokalizacije. Pri vzorcih, ki so vsebovala nanotelo in pri tistih brez nanotelesa, ni bilo opaznih razlik v deležu celične smrti. Na osnovi našega dela smo zaključili, da nanotelo M33 ne zmanjša deleža celične smrti.20192019-09-10 12:05:06Magistrsko delo/naloga109927sl