Optimizacija izražanja rekombinantnega proteina FHL2Škrinjar, Peter (Avtor) Lenarčič, Brigita (Mentor) FHL2inkluzijska telescahkratno izražanjeβ-kateninFHL2 je adapterski protein, ki je sestavljen iz štirih in pol domen LIM, preko katerih tvori interakcije z ostalimi proteini. Med posameznimi domenami LIM se nahajajo intrinzično neurejene regije, ki dajejo proteinu fleksibilnost in mu s tem omogočajo vezavo s široko paleto različnih proteinov. Zaradi tega je FHL2 del številnih signalnih poti, ki so povezane z različnimi celičnimi procesi. Vidno vlogo ima tudi pri celičnem signaliziranju preko molekule EpCAM, ki se povišano izraža v rakavih celicah. Kot adapterski protein je FHL2 ključen pri tvorbi kompleksa EpIC-FHL2-β-katenin, ki nastane v citoplazmi in se nato prenese v jedro, kjer z vezavo na transkripcijski faktor Lef-1 sproži prepisovanje onkogenov, ki povzročijo proliferacijo celic. Mehanizem tvorbe kompleksa EpIC-FHL2-β-katenin ni razjasnjen, prav tako ni znana niti njegova struktura. Cilj našega dela je bil optimizirati izražanje rekombinantnega proteina FHL2 in ga pripraviti v zadostnih količinah, da bi ga lahko uporabili za strukturno in biokemijsko karakterizacijo kompleksa EpIC-FHL2-β-katenin. FHL2 se po induciranem izražanju v bakterijskih celicah nahaja v netopni frakciji, zato ga je potrebno izolirati iz inkluzijskih telesc. V sklopu našega raziskovalnega dela smo izvedli tri različne poskuse izolacije FHL2 iz inkluzijskih telesc in njihovo uspešnost primerjali med seboj. Pri vseh treh eksperimentih so se največje izgube pojavile pri procesu raztapljanja, po katerem je rekombinantni protein FHL2 ostal v obliki topnih agregatov, kljub prisotnosti denaturanta. Najobetavnejše rezultate je sicer pokazala izolacija, pri kateri smo pri procesu raztapljanja inkluzijskih telesc v 8 M urei dodali še neionski detergent Triton X-100, ki preprečuje tvorbo agregatov. Kljub znatnim količinam izoliranega fuzijskega proteina smo po dializi, pri kateri smo fuzijski protein cepili s proteazo TEV, ugotovili, da je FHL2 v raztopini podvržen razgradnji. Zaključili smo, da je izolacija rekombinantnega proteina FHL2 iz inkluzijskih telesc zaradi agregacije in nestabilnosti proteina nesmiselna. Ocenili smo, da bo bolj primerna metoda za pripravo proteina hkratno izražanje z njegovim vezavnim partnerjem. To je tudi v skladu z vlogo proteina FHL2 v celici, kjer se ta kot adapterski protein praktično nikoli ne nahaja sam, temveč je vedno v kompleksu z ostalimi proteini. Pri izvedbi koekspresije, kjer sta se zapisa za FHL2 in β-katenin nahajala vsak na svojem plazmidu, sta se proteina izražala v nivoju, zelo daleč od stehiometrijskega. V nadaljevanju smo se zato odločili, da bomo koekspresijo izvedli z zapisom obeh proteinov pod svojim promotorjem T7 na enem plazmidu in na ta način pridobili stabilen kompleks FHL2-β-katenin, s pomočjo katerega bo možno preučevanje interakcijskih in strukturnih lastnosti celotnega kompleksa EpIC-FHL2-β-katenin.20192019-09-09 18:05:06Diplomsko delo/naloga109886sl