Inaktivacija gena metiltransferaze oxyF iz genske skupine za biosintezo oksitetraciklina v bakteriji Streptomyces rimosus.Pšeničnik, Alen (Avtor) Petković, Hrvoje (Mentor) AktinomiceteStreptomyces rimosustetracikliniinaktivacija genametiltransferazaoksitetraciklinStreptomyces rimosus je pomemben industrijski mikroorganizem, ki proizvaja oksitetraciklin, antibiotik širokega spektra. V medicini in veterini se trenutno uporablja več polsinteznih tetraciklinksih antibiotikov. Zaradi širjenja bakterijske rezistence narašča interes po odkritju novih naravnih tetraciklinov in njihovih biosinteznih intermediatov, uporabnih za razvoj novih, bolj učinkovitih antibiotikov. Cilj tega dela je bila inaktivacija gena metiltransferaze oxyF znotraj genske gruče za biosintezo oksitetraciklina in identifikacija tarčnega produkta, 6-demetiloksitetraciklina. Konstruirali smo plazmid, ki vsebuje DNK fragment s homologijo regijam v okolici gena oxyF v genomu S. rimosus, vendar brez večjega dela gena oxyF. Na ta način konstruiran fragment DNK smo nato vstavili v »samomorilski« plazmid, imenovan pKC1139. pKC1139 vsebuje mesto za podvojevanje v E. coli in primerne gene za rezistenco na antibiotike, ki omogočajo selekcijo v E .coli in S. rimosus. Po transformaciji v S. rimosus smo uporabili dvostopenjski proces z integracijo v genom, ki ji je sledila delecija večjega dela gena oxyF, oboje preko homologne rekombinacije. Nato smo poiskali transformante S. rimosus z natančno inaktivacijo gena oxyF. Po kultivaciji smo analizirali metabolni profil izbranih kolonij z tankoplastno kromatografijo. Z uporabo masne spektrometrije smo potrdili produkcijo sicer nizkih količin 6-demetil oksitetraciklina.[A. Pšeničnik]20192019-06-16 07:45:10Magistrsko delo/naloga108104sl