Vrednotenje zaviralcev imunoproteasoma z elektrofilnim oksatiazolonomOčko, Sara (Avtor) Gobec, Martina (Mentor) proteasomzaviralci imunoproteasomaoksatiazoloniencimska kinetikaImunoproteasom je visoko učinkovit proteazni kompleks, ki se pretežno nahaja v celicah imunskega sistema, kjer sodeluje pri antigenski predstavitvi, uravnavanju izločanja citokinov in diferenciaciji ter proliferaciji limfocitov T. Pod vplivom vnetnih dejavnikov se lahko njegov nastanek inducira tudi v vseh ostalih celicah, kjer se vse tri katalitično aktivne β podenote konstitutivnega proteasoma (β1, β2 in β5) zamenjajo z ustreznimi homolognimi podenotami imunoproteasoma (β1i, β2i in β5i). Njegovo povišano aktivnost povezujejo z nekaterimi vnetnimi, rakavimi in avtoimunskimi obolenji, zato imajo selektivni zaviralci imunoproteasoma velik terapevtski potencial pri zdravljenju teh obolenj. S tem namenom smo v sklopu magistrske naloge kot potencialne zaviralce imunoproteasoma vrednotili deset novih spojin osnovanih na elektrofilnem oksatiazolonu. Z metodami encimske kinetike smo najprej na β5i podenoti določili IC50 vrednosti. Slednje so bile za vse spojine v območju 0,10 – 0,43 µM, pri čemer so najnižjo IC50 izkazovale spojine 55, 172 in 176. Nadalje smo preverili selektivnost zaviralcev v primerjavi z drugimi katalitično aktivnim podenotam imunoproteasoma (β1i, β2i) in proteasoma (β1, β2, β5). Ugotovili smo, da je pri uporabi 10 µM koncentracije spojin, rezidualna aktivnost na vseh ostalih podenotah za spojine 55, 57 in 176 bila nad 60%, zato lahko sklenemo, da te spojine izkazujejo selektivno delovanje na β5i podenoto imunoproteasoma. Spojini 55 in 172 sta imeli najnižjo IC50 za β5i podenoto in sta hkrati dobro selektivni v primerjavi z ostalimi podenotami, zato smo se odločili, da ju še dodatno ovrednotimo. V prvem delu smo preverili ali spojini ohranita svoje zaviralne lastnosti tudi v heterogenih proteinskih sistemih. Zato smo pripravili celične lizate iz celic THP-1 in HeLa. Moč zaviranja na celičnih lizatih se je glede na izolirano β5i podenoto zmanjšala za približno 10-krat, kar nakazuje, da so v kompleksnejših sistemih prisotni tudi drugi proteini na katere se spojini vežeta oziroma jih zavirata. Nadalje smo preverili ali te spojine uspešno prehajajo celice v in vitro pogojih. Ugotovili smo, da je rezidualna aktivnost pri 25 µM koncentraciji za spojino 55 65%, za 172 pa 74%. To kaže na slabo permeabilnost spojine preko intaktne celične membrane in potrebo po optimizaciji strukture. Ne glede na to, smo na koncu preverili ali spojine posredujejo imunomodulatorne učinke na perifernih mononuklearnih celicah (PBMC) zdravih posameznikov. PBMC-je smo aktivirali z lipopolisaharidom in preverili ali spojini vplivata na izločanje vnetnih citokinov (IL-1β, TNFα, IL-8, IL-6, IL-10 in IL-12p70). Ugotovili smo, da statistično znižanje IL-6 in IL-10 povzroči le spojina 172. Podoben trend smo opazili tudi pri spojini 55, a ni bil statistično značilen. Spojine so pokazale potencial kot selektivni zaviralci β5i podenote imunoproteasoma, ki pa bi potrebovale nadaljnjo strukturno optimizacijo, ki bi omogočila boljšo prehodnost preko celične membrane.20192019-02-06 08:35:07Magistrsko delo/naloga106172sl