Interakcije listeriolizina O s holesterolomKozorog, Mirijam (Avtor) Anderluh, Gregor (Mentor) Plavec, Janez (Komentor) listeriolizin OListeria monocytogenesod holesterola odvisni citolizinivezava na membraneholesteroljedrska magnetna resonanca (NMR)Patogeni organizmi so razvili številne mehanizme, da se izognejo imunskemu sistemu gostitelja in se v njegovih celicah nadalje razmnožujejo. V ta namen izločajo različne virulenčne dejavnike, ki preko interakcij s komponentami gostiteljskih celic omogočijo preživetje patogenov. Glavni virulenčni dejavnik bakterije Listeria monocytogenes, ki je živalski in človeški patogen, je 56,4 kDa protein listeriolizin O (LLO). LLO se veže na membrane, bogate s holesterolom, v njih tvori pore ter s tem listeriji omogoči pobeg iz kislega fagosoma in njeno nadaljnje širjenje v sosednje celice in tkiva gostitelja. V doktorskem delu smo na molekularnem nivoju preučevali vezavo LLO na holesterol ter interakcije proteina z membranami, kar v literaturi še ni podrobno pojasnjeno. V ta namen smo izrazili rekombinanten LLO z vsemi sedmimi triptofanskimi ostanki označenimi z izotopom 19F (19F-LLO). Ugotovili smo, da se LLO močno veže na sam holesterol v raztopini, vendar pa noben od preučevanih triptofanskih ostankov, ki so izpostavljeni na dnu vezavne domene LLO, v vezavo ni bil direktno udeležen. Nasprotno smo pri študijah z 19F NMR spektroskopijo v trdnem opazili spremembe v kemijskih premikih treh triptofanskih ostankov LLO proteina, ko je bil le-ta vezan na s holesterolom bogate fosfolipidne vezikle. Glede na literaturo in rezultate izvedenih testov hemolitične aktivnosti triptofanskih mutant sklepamo, da so omenjeni triptofanski ostanki vključeni v oligomerizacijo proteina LLO v procesu tvorbe pore (W189 in W489) oziroma v interakcije z membranami (W512). Nadalje smo s setom NMR eksperimentov v trdnem pokazali, da vezava LLO na s holesterolom bogate membrane različnih sestav ne poruši organizacije lipidnega dvosloja, se pa v prisotnosti bolj fluidnih membran poveča mobilnost fosfolipidnih glav ter fluidnost hidrofobnega dela fosfolipidnega dvosloja. Na takšnih membranah opazimo tudi večji delež vezanega proteina kot na bolj rigidnih membranah pri isti mejni molski koncentraciji holesterola, ki je še zadostna za vezavo LLO na membrane. Z določevanjem relaksacijskih hitrosti holesterola smo ugotovili, da na membrane vezan LLO močno interagira z membranskim holesterolom v okolici njegovih ogljikovih atomov C3 in C4. Doktorsko delo tako omogoča podrobnejši vpogled v interakcije toksina LLO s holesterolom in s s holesterolom bogatimi fosfolipidnimi dvosloji. Pokaže tudi učinkovitost uporabe tehnik aminokislinsko specifičnega izotopskega označevanja večjih proteinov, ki omogočajo interakcijske študije podobno velikih proteinov z lipidnimi molekulami in membranskimi sistemi na molekularnem nivoju s tehnikama NMR v raztopini in NMR v trdnem. Tekom naloge so bili razviti tudi modelni lipidni sistemi na osnovi arhejskih lipidov, ki so uporabni za raziskave interakcij proteinov z lipidnimi membranami.20192019-01-18 07:45:02Doktorsko delo/naloga106038sl