Površinska predstavitev evazinov in bepecina na bakterijah Lactococcus lactis NZ9000 in Lactobacillus salivarius ATCC 11741 ter vrednotenje njihovega protivnetnega delovanjaŠkrlec, Katja (Avtor) Berlec, Aleš (Mentor) mlečnokislinske bakterijeLactococcus lactisLactobacillus salivariuspovršinska predstavitevevazinibepecinprotivnetnega delovanjakronična vnetna črevesna bolezenKronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je vse večji zdravstveni problem, saj incidenca in prevalenca bolezni naraščata, obenem pa je zdravljenje z biološkimi zdravili drago in povzroča neželene stranske učinke, zato razvoj novih načinov zdravljenja predstavlja velik znanstveni izziv. Kemokini in citokini imajo ključno vlogo pri vnetnem odzivu v gastrointestinalnem traktu, zato predstavljajo možno novo tarčo zdravljenja vnetnih bolezni. Glavni namen doktorske disertacije je bil razvoj mlečnokislinskih bakterij (MKB) Lactococcus lactis NZ9000 in Lactobacillus salivarius ATCC 11741, ki bi imele na površini predstavljene ustrezne vezavne proteine, s katerimi bi bilo moč doseči protivnetno delovanje in izboljšati simptome vnetja. Potrdili smo, da so kemokin-vezavni klopni proteini evazini primerni za površinsko predstavitev na MKB Lactococcus lactis NZ9000 in Lactobacillus salivarius ATCC 11741. Kot alternativni način protivnetnega delovanja pri vnetnih črevesnih boleznih smo uspešno razvili dostavni sistem za protivnetni peptid bepecin (BPC-157) s pomočjo fuzije z ustreznim nosilnim površinskim proteinom. Nadzorovano sproščanja bepecina smo dosegli s pomočjo v črevesju prisotne proteaze tripsin ali s pomočjo signalnega peptida. Razvili smo tudi sistem spremljanja in kvantifikacije izločenega bepecina. Učinkovitost obeh novih pristopov k zdravljenju vnetnih črevesnih bolezni smo potrdili na celičnih modelih, in sicer smo zmožnost vezave kemokina CXCL8 potrdili na modelu črevesnega epitela, antioksidativno delovanje bepecina pa na celičnem modelu fibroblastov. Poleg vezave kemokinov bi lahko k zdravljenju vnetnih črevesnih bolezni pristopili tudi z vezavo citokinov. Zato smo na površini bakterije Lactococcus lactis NZ9000 predstavili neimunoglobulinske proteinske nosilce, pripravljene na osnovi albumin-vezavne domene, ki so sposobni vezati podenoto p19 človeškega IL-23 (ILP-vezavni proteini). Z vezavo bi lahko preprečili interakcijo med IL-23 in receptorjem ter tako zaustavili z IL-23 posredovano provnetno signaliziranje. Neimunoglobulinski proteinski nosilci predstavljajo alternativo protitelesom. S pregledom njihovih tarč smo izpostavili primerne vezavne proteine za predstavitev na MKB z namenom protivnetnega delovanja. Za učinkovito protivnetno delovanje je pomembna zadostna količina protivnetnih proteinov ali peptidov na mestu delovanja. Na količino izraženih proteinov lahko vplivamo z optimizacijo gostiteljskega seva MKB, pri katerem lahko z inaktivacijo ali utišanjem določenih genov vplivamo na povečano tvorbo rekombinantnih proteinov ali njihovo zmanjšano razgradnjo. Predhodno razviti plazmid pNZDual z dvema nizinskima promotorjema smo uporabili za razvoj enoplazmidnega inducibilnega sistema CRISPR-Cas9, ki omogoča inaktivacijo ali utišanje genov z uporabo tehnologij CRISPR in CRISPRi, in bo v nadaljevanju uporaben za inaktivacijo kandidatnih genov z namenom povečanja izražanja protivnetnih proteinov. Želeno protivnetno delovanje bakterij bi lahko izboljšali z uvedbo ustreznega dostavnega sistema, s katerim bi bakterije zaščitili in dostavili na mesto vnetja. Novejši dostavni sistem predstavljajo nanovlakna, ki bi lahko omogočala vgradnjo MKB in njihovo dostavo na ustno ali vaginalno sluznico, s čimer bi razširili možnosti zdravljenja vnetnih bolezni. V okviru doktorskega dela smo proučili vpliv procesnih parametrov elektrostatskega sukanja in parametrov polimerne raztopine na morfologijo nanovlaken ter sposobnost preživetja vgrajene modelne MKB Lactobacillus plantarum ATCC 8014. Učinkovita vgradnja probiotičnih bakterij v nanovlakna nam omogoča sočasno sušenje bakterij in pripravo bolniku prijaznega lokalnega dostavnega sistema z dolgim rokom uporabnosti in hitrim sproščanjem, s katerim bakterije zaščitimo ter dostavimo na mesto vnetja.20182018-12-06 07:15:24Doktorsko delo/naloga105556sl