Interakcija proteina Usp bakterije Escherichia coli z evkariontskimi celicamiZalokar, Danijela (Avtor) Žgur Bertok, Darja (Mentor) Escherichia coliuropatogeni specifični proteinUspgenotoksinizolacija proteinaprotein Imu3Usp-GFPEscherichia coli (E. coli) je izredno raznolik organizem. Je komenzal, ki naseljuje prebavni trakt vretenčarjev in je sestavni del njihove mikrobiote. Po drugi strani pa je ta bakterija pomemben patogeni organizem, ki povzroča črevesne in izvenčrevesne okužbe. Med izvenčrevesnimi patogenimi E. coli so zelo pogoste uropatogene E. coli (UPEC). UPEC pretežno uvrščamo v filogenetsko skupino B2 in so odgovorne za kar 80 % okužb urinarnega trakta. Večina ima zapis za Usp – uropatogeni specifični protein. Usp je homologen nukleaznim piocinom in kolicinom in ima in vitro DNazno aktivnost. Predvidevali so, da je bakteriocin, a se je izkazalo, da nima bakteriocidnega učinka na bakterije, ima pa genotoksičen vpliv na evkariontske celice – torej je Usp genotoksin. Navzdol od usp se nahajajo trije geni z zapisom za proteine Imu. Ti imajo vlogo zaščite producenta pred nukleaznim delovanjem Usp. Imu3 reverzibilno veže DNA in promovira genotoksičnost proteina Usp. Cilj magistrske naloge je bila priprava fuzijskega rekombinantnega proteina Usp-GFP, katerega aktivnost bo primerljiva aktivnosti nativne oblike proteina Usp. Optimizirali smo pridobivanje Usp-GFP. Sev E. coli BL21 (DE3) pLyseE transformiran s pTHCG12U smo gojili pri 30 °C, produkcijo proteina Usp-GFP pa smo inducirali z 0,1 mM IPTG. Protein smo izolirali s pomočjo Ni-NTA afinitetne kromatografije, ga očistili s FPLC ter nato preverili njegovo aktivnost. Pripravili smo še izolate Usp in Imu3. Izkazalo se je, da ima Usp-GFP DNazno aktivnost in vpliv na količino biomase HUVEC celic. Njegova in vitro in in vivo aktivnost je primerljiva aktivnosti nativne oblike Usp. Usp-GFP je uporabno orodje za nadaljnje raziskave interakcije proteina Usp z evkariontskimi celicami.20182018-10-13 07:45:33Magistrsko delo/naloga104865sl