Testiranje izbranih učinkovin za inhibicijo modificirane 6-fosfofrukto-1-kinaze v metastaznih rakastih celicah.Čamernik, Katja (Avtor) Legiša, Matic (Mentor) metabolizem rakavih celicrakave celiceencimilaktatPfk-L encimNADHEncim 6-fosfofrukto-1-kinaza je eden od najpomembnejših regulatornih encimov glikolize. Pri ljudeh najdemo 3 tipe encima, ki so različno izraženi v posameznih tkivih. Za številne tipe raka je značilna, povečana ekspresija izoforme Pfk-L, ki smo jo v raziskavi uporabili, za testiranje inhibicije aktivnosti, ob dodatku izbranih inhibitorjev. Z Gibson assembly tehnologijo smo v plazmidnem vektorju p416GPD pripravili rekombinantni humani nPFKL in sfPFKL gen in ju vnesli v PFK-null sev kvasovke (HD114-8D). Encim nPfk-L smo po namnožitvi v kvasovkah izolirali do homogenosti s frakcionirnim obarjanjem in afinitetno kromatografijo, medtem, ko smo zaradi nestabilnosti transformante sfPFKL, encim sfPfk-L le delno prečistili s frakcionirnim obarjanjem z amnosulfatom. Oba očiščena encima smo uporabili za testiranje inhibicije aktivnosti ob dodatku 15 izbranih inhibitorjev. Uspeli smo določiti tiste, ki bolje inhibirajo aktivnost nPfk-L encima, oziroma tiste, ki bolje inhibirajo sfPfk-L encim, kar predstavlja potencial za tarčno zdravljenje tumorjev. Ugotovili smo tudi, da so transformante z vnesenim nPFKL precej stabilne medtem, ko je sam encim nPfk-L v 30 min neprekinjene meritve, praktično izgubil vso aktivnost. Obratno pa so transformante z vnesenim sfPFKL genom izredno nestabilne, saj so precej hitro izgubile plazmid z vnesenim genom, sam encim sfPfk-L, ki smo ga nekaj sicer uspeli izolirati iz sveže pripravljene transformante pa je bil bolj stabilen.[K. Čamernik]20182018-09-29 07:45:29Magistrsko delo/naloga103957sl