Modulation of IL-6 signaling axis by splice-switching gene therapy tools as a novel therapy against chronic inflammatory diseasesOrehek, Sara (Avtor) Štrukelj, Borut (Mentor) El-Andaloussi, Samir (Komentor) Interlevkin-6oligonukleotidiki povzročijo preklopitev izrezovanjaglikoprotein 130topen glikoprotein 130genska terapijakronične vnetne boleznitrans-signaliziranje IL-6biotehnologijaKronične vnetne bolezni so izčrpavajoče dolgotrajne bolezni, njihov nastanek in razvoj pa sta močno povezana z disregulacijo v signalnem omrežju citokinov. Rezultati številnih raziskav so pokazali, da je trans-signaliziranje interlevkina 6 (IL-6) pomemben vnetni mediator, ki je prisoten v mnogih patogenezah, ki zajemajo razvoj, napredovanje in vzdrževanje številnih kroničnih vnetnih bolezni in različnih vrst raka. Zato se moramo nanj osredotočiti pri razvoju novih protivnetnih zdravil in zdravil, ki preprečujejo raka. Glavni namen te magistrske naloge je, da bi z gensko terapijo preklopitve izrezovanja (splice-switching) spodbudili alternativno izrezovanje eksonov 9 in 15 na primarnem prepisu RNA (pre-mRNA) glikoproteina 130 (Gp130), s čimer bi tvorili topni izoobliki Gp130, imenovani sGp130-RAPS in sGp130-Sharkey. Topne izooblike namreč nimajo transmembranskih in citoplazemskih domen ter so naravni antagonisti trans-signaliziranja IL-6, zato predstavljajo obetaven pristop k zdravljenju obolenj, ki so posledica provnetnega delovanja IL-6. Z uporabo posebej izdelanih oligonukleotidov, ki povzročijo preklopitev izrezovanja (SSO), usmerjenih proti spojitvenima mestoma 5′ in 3′, ter eksonskih ojačevalcev (ESE) za eksona 9 in 15, smo spremenili alternativno izrezovanje in uspešno pridobili informacijski RNA (mRNA) obeh topnih izooblik Gp130 v različnih človeških in mišjih celičnih linijah. Na ravni proteinov ni bilo mogoče zaslediti topnih izooblik, saj so zaporedja mRNA s spremenjenim alternativnim izrezovanjem pogosto substrati nesmiselno povzročenega razpada (NMD) in se ne pretvarjajo v proteine. Poleg tega je tretiranje izbranih celic s SSO privedlo do dvojnega zniževanja ravni izražanja Gp130, kar pomeni, da so oligonukleotidi vplivali na proizvodnjo tako topnih izooblik kot tudi celotnih, na membrano vezanih receptorjev Gp130. Za zdravljenje predstavlja dvojno zniževanje ravni izražanja Gp130 pozitivni vidik, saj omogoča zaviranje patogeneze bolezni, pri tem pa ohranja pomembne funkcije IL-6 nedotaknjene. Ob klasičnem alternativnem izrezovanju eksonov predstavlja alternativna intronska poliadenilacija (IPA) dodaten mehanizem za pridobivanje izooblik proteinov. Poleg tega so zaporedja mRNA, ki so nastala kot posledica uporabe intronskih alternativnih poli(A) mest (PAS), naravno imuna na NMD. Da bi se izognili nesmiselno povzročenemu razpadu pri zaporedjih mRNA, smo v genu za Gp130 preverili še prisotnost intronskih mest PAS; ta so bila domnevno prisotna v intronih 9, 10 in 11. Na podlagi dobljenih rezultatov lahko zaključimo, da imajo SSO in uporaba naravno prisotnih intronskih mest PAS v genu za Gp130 potencial kot novi obliki terapije za zdravljenje kroničnih vnetnih bolezni. V prihodnosti bi obe metodi za pridobivanje topnih izooblik proteinov lahko uporabljali kot protivnetno zdravilo.[S. Orehek]20182018-09-13 07:46:44Magistrsko delo/naloga103028sl