Iskanje in izražanje lizinov bakteriofagov bakterij vrste Staphylococcus epidermidis in Propionbacterium acnes.Čibej, Boštjan (Avtor) Accetto, Tomaž (Mentor) Peterka, Matjaž (Komentor) mikrobna odpornostliziniStaphylococcus epidermidisPropionibacterium acnesekspresijski sistemEscherichia coliLizini so bakteriofagni encimi, ki hidrolizirajo celično steno bakterij pri litičnem ciklu fagnega razmnoževanja. Namen magistrske naloge je bil vzpostaviti produkcijski sistem za heterologno izražanje lizinov, ki bi bili litični za bakterijski vrsti Propionibacterium acnes in Staphylococcus epidermidis. Ti dve vrsti sta znani kot povzročiteljici bolnišničnih okužb in nekaterih bolezenskih stanj pri človeku. V ta namen smo iz bakteriofagov, ki okužujejo ti bakterijski vrsti, izolirali lizinske gene z verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Pri fagu E1, specifičnem za bakterije vrste P. acnes, nam ni uspelo pridobiti celotne genske sekvence lizina, zato lizinov pri tej bakteriji nismo izražali. Pri stafilokoknem fagu K (StphK) smo pridobili tri lizinske gene: 114, 154 in 156. Z rekombinantnimi tehnikami smo jih klonirali v plazmidna vektorja pQE-80L in pMAL-C5X in s transformacijo vstavili v ekspresijska seva E. coli (Top10 in Er2523). Plazmide z vključki, ki so jih vsebovale transformante, smo sekvencirali, da bi pridobili lizinske gene brez mutacij. Skupno smo pridobili trinajst lizinskih genov v obeh vektorjih. Gene z minimalnim številom mutacij smo uporabili za izražanje. Da bi čim bolj zmanjšali število mutacij v najdaljšem genu 114, smo pri PCR uporabili polimerazo Phusion, ki velja za natančnejšo od polimeraze Taq, a se to ni izkazalo za uspešno. Izražanje je bilo uspešno pri vključkih v pMAL-C5X, pri vključkih v pQE-80L pa ne. Pri pMAL-154 smo na poliakrilamidnem gelu zaznali avtoproteolizo, pri pMAL-114 pa proteolitsko razgradnjo. Lizine smo delno očistili iz bioprocesnega medija do stopnje celičnih lizatov. Test topnosti je pokazal, da se lizini nahajajo tako v topni kot netopni frakciji. Celični lizati z vsebovanimi lizini niso bili litični za stafilokokni sev SeC2, kar smo preverili s testom aktivnosti z metodo štetja kolonij na ploščah.[B. Čibej]20182018-09-12 07:45:23Magistrsko delo/naloga102909sl