Elektrogenska terapija z interlevkinom 12 za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psihLampreht Tratar, Urša (Avtor) Čemažar, Maja (Mentor) genski elektroprenos interlevkin 12 veterinarska onkologija pasje maligne melanomske celične linije klinična študijaZnanstveno izhodišče: Spontani tumorji pri psih predstavljajo odličen model za preizkušanje novih terapij in za njihov prenos v humano onkologijo. Ena izmed novih terapij, ki se je izkazala za izredno učinkovito za zdravljenje tumorjev pri psih in ljudeh je elektrokemoterapija. Elektrokemoterapija je lokalno zdravljenje, katera ima velik uspeh na lokalnem nivoju, vendar ne na sistemskem. Kot dodatno terapijo s sistemskim učinkom, bi lahko uporabili elektrogensko terapijo z interlevkinom-12 (IL-12), ki je v nekaterih predkliničnih in kliničnih študijah izboljšala odgovor na zdravljenje. IL-12 je provnetni citokin, ki preko interferona gama (IFNɣ) poveča delovanje protitumorskega imunskega odziva. V kliničnih študijah, kjer so uporabili kombinacijo elektrokemoterapije in elektrogenske terapije z IL-12 za zdravljenje spontanih tumorjev pri psih, so dokazali dobro protitumorsko učinkovitost. V teh študijah so uporabili plazmid, ki je nosil zapis za humani ali mačji IL-12, ki nima popolne homolognosti s pasjim IL-12. Poleg tega je nosil zapis za gen za odpornost proti ampicilinu, katerega pristojne organizacije ne odobravajo. Zato je priprava plazmida, ki bi nosil zapis za pasji IL-12 z ali brez gena za odpornost proti antibiotiku, ključna za uporabo v nadaljnjih kliničnih študijah na psih. Metode: V prvem sklopu smo pripravili in ovrednotili plazmide, ki nosijo zapis za pasji IL-12 pod konstitutivnim ali tkivno specifičnim promotorjem in z ali brez gena za odpornost proti antibiotiku. Poskuse smo v in vitro pogojih opravili na humanih in pasjih normalnih in tumorskih celičnih linijah ter spremljali stopnjo izražanja IL-12 na nivoju mRNA in na proteinskem nivoju po genskem elektroprenosu. V in vivo pogojih smo na ksenograftih pasjih melanomskih celic na imunsko oslabljenih miših poleg protitumorskega učinka spremljali tudi imunski odziv po genskem prenosu IL-12. Nenazadnje smo prijavili klinično študijo na pristojne organe ter začeli z vključevanjem pacientov v klinično študijo, kjer smo s kombinacijo elektrokemoterapije in elektrogenske terapije zdravili spontane kožne in oralne tumorje pri psih. Tekom terapije smo merili velikosti tumorjev in jemali vzorce krvi, urina in blata, ter brise z mesta aplikacije plazmida za določanje varnosti in učinkovitosti terapije. Rezultati: Rezultati so pokazali, da ima novi plazmid, ki nosi zapis za pasji IL-12 podobno ali višjo zmožnost ekspresije v in vitro pogojih na nivoju mRNA in proteinov kot plazmid, ki nosi zapis za humani IL-12. V in vivo poskusu na imunsko komprimiranih miših smo ugotovili, da je terapevtska učinkovitost po elektrogenskem prenosu primerljiva med plazmidoma, ki nosita zapis za pasji ali humani IL-12. V primeru plazmidov, ki nosijo zapis za pasji IL-12 pod konstitutivnim in tkivno specifičnim promotorjem ter nimajo gena za odpornost proti antibiotiku smo ugotovili, da odstranitev gena za odpornost proti antibiotiku ne zmanjša citotoksičnosti ter sposobnosti ekspresije transgena. V in vivo študiji smo ugotovili, da ima plazmid s konstitutivnim promotorjem višjo ekspresijo IL-12 kot plazmid s tkivno specifičnim promotorjem. Poleg tega je po genskem elektroprenosu plazmid s konstitutivnim promotorjem povzročil povišano vrednost IL-12 v serumu medtem, ko je bilo izražanje IL-12 v primeru tkivno specifičnega promotorja omejeno na tumor. Nenazadnje je bilo v primeru konstitutivnega promotorja zaznana povišana infiltracija grancim B pozitivnih celic v tumorju in vranici, kar kaže na sistemski učinek terapije. Po genskem elektroprenosu IL-12 smo opazili tudi povišano infiltracijo M1 makrofagov ter dendritičnih celic v tumorju na imunsko nezavrtih miših. V klinično študijo smo vključili 55 psov, 42 s kožnimi tumorji in 13 z oralnimi tumorji. V primeru kožnih tumorjev smo dosegli popolni odgovor pri 84 % pacientov. Odgovor je bil slabši pri oralnih tumorjih, kjer je delež popolnih odgovorov znašal 15 %. Pri preiskovanju zbranih vzorcev urina, blata in seruma, nismo zaznali prisotnosti plazmidne DNA. V primeru brisov kože smo pri nekaterih pacientih zaznali prisotnost plazmidne DNA takoj po aplikaciji (najvišja je bila 100 ng/mL), ki je v 4 tednih padla na ničelno vrednost. Poleg tega smo v krvi merili deleže imunskih celic po terapiji, kjer smo ugotovili statistično značilen upad celic T zaviralk ob koncu opazovanega obdobja, glede na delež celic T zaviralk ob terapiji. Zaključek: Novo pripravljeni plazmid, ki kodira pasji IL-12 in ima gen za odpornost proti kanamicinu, ima enako učinkovito stopnjo izražanja IL-12 ter enak protitumorski učinek kot plazmid, ki nosi zapis za humani IL-12. Uporaba novega plazmida v kombinaciji z elektrokemoterapijo za zdravljenje spontanih kožnih in oralnih tumorjev pri psih se je izkazala za varno ter učinkovito. Poleg tega novo pripravljeni plazmidi, ki nosijo zapis za pasji IL-12 pod tkivno specifičnim ali konstitutivnim promotorjem brez gena za odpornost proti antibiotikom, predstavljajo učinkovito orodje za nadaljnje klinične študije, ki so nujno potrebne za uspešno translacijo te terapije v humano medicino.20182018-08-23 07:15:17Doktorsko delo/naloga102360sl