Detekcija genomskih sprememb povzročenih z metodo CRISPR/Cas9 pri ovarijskih celicah kitajskega hrčka z analizo talilne krivulje visoke ločljivosti.Žnidaršič, Ažbe (Avtor) Štrukelj, Borut (Mentor) Vogelsang, Matjaž (Komentor) CHOHRMCRISPR/Cas9NGSpregledovanjegenetske spremembeMetoda CRISPR/Cas9 je najbolj uporabljena metoda tarčnega spreminjanja genoma. Pregledovanje in identifikacija CRISPR/Cas9 spremenjenih celičnih klonov je drag ter časovno in delovno zahteven postopek. Metoda analize talilne krivulje visoke ločljivosti (HRM) je hitra in stroškovno ugodna metoda detekcije CRISPR/Cas9 induciranih DNA sprememb. Z izbranimi reagenti smo po izolaciji gDNA, izolat gDNA iz ovarijskih celic kitajskega hrčka (CHO) 5-krat redčili, saj smo ugotovili, da ta redčitev omogoča najbolj ponovljive vrednosti Tm talilnih krivulj. Metoda HRM je uspešna ob uporabi vsaj 5000 celic CHO na vzorec. Z metodo HRM smo preverili prisotnost genetskih sprememb tarčnih regij v 105 klonih celic CHO. Vsak izmed klonov je bil tarčno spremenjen v enem od petih genov, na dveh mestih v genu hkrati. V nekaterih primerih smo pridobili talilne krivulje, ki zelo odstopajo od pričakovanih. Odstopajo predvsem rezultati tistih klonov, kjer smo zaradi velike oddaljenosti med tarčnima mestoma v genu, za pomnoževanje z reakcijo PCR uporabili dva para začetnih oligonukleotidov. Po izločitvi teh klonov iz analize rezultatov HRM ter njihovi določitvi kot genetsko spremenjene, smo primerjali rezultate metode HRM z rezultati metode naslednje generacije sekvenciranja (NGS). Genetske spremembe inducirane s sistemom CRISPR/Cas9 pri celicah CHO smo z metodo HRM določili s 95 % točnostjo in 96 % občutljivostjo glede na metodo NGS. Ob hkratni analizi dveh tarčnih mest v isti tarčni regiji z enim parom začetnih oligonukleotidov, smo genetske spremembe določili s 100 % natančnostjo metode HRM.[A. Žnidaršič]20182018-07-07 07:45:16Magistrsko delo/naloga101819sl