Predstavitev krajših peptidnih ligandov eritropoetinskega receptorja na nitastem bakteriofagu in vrednotenje njihove vezave na receptorJerman, Marjeta (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Molek, Peter (Komentor) detekcija dopinga bioanalizne metode agonisti eritropoetinskega receptorja predstavitev na bakteriofagu peptidni ligandiNabor substanc za povečanje vzdržljivosti športnikov se nenehno povečuje, zato jim razvoj detekcijskih metod le stežka sledi. Ena izmed ovir obstoječih metod je visoka specifičnost, ki omogoča detekcijo že znane spojine, ne pa njihovih analogov ali mimetikov. Posledično je razvoj takšnih metod zamuden, njihova uporaba pri vsakodnevnih protidopinških aktivnostih pa draga. Raznolikost sodobnih substanc za povečanje vzdržljivosti športnikov zahteva razvoj naprednih bioanaliznih metod z uporabo znanja s področja biotehnologije in molekularne medicine. Namen magistrske naloge je načrtovanje in priprava ustrezne detekcijske sonde za določanje agonistov receptorja za eritropoetin v bioloških vzorcih. V ta namen smo na bakteriofagih delcih predstavili krajše peptidne ligande eritropoetinskega receptorja. Genski konstrukt za peptidni mimetik eritropoetina (EMP1) smo vnesli v bakteriofagni vektor M13KBE. Pripojili smo ga genu za kapsidni protein p3 in s tem omogočili njegovo predstavitev na površini bakteriofaga v fuziji s proteinom p3. Z izbranim vektorjem smo dosegli pentavalentno predstavitev peptida. Dodatno smo s podobnim pristopom kloniranja in uporabo vektorja pIT2 na površini bakteriofaga v monovalentni obliki izrazili posamezne peptidne ligande eritropoetinskega receptorja (EMP1, EMP5 in AF11154), prav tako v fuziji s proteinom p3. Z encimsko imunskimi testi (ELISA) smo potrdili vezavo fagnih delcev na rekombinantno zunajcelično domeno eritropoetinskega receptorja (EpoR), pri čemer je najnižjo afiniteto pričakovano izkazoval peptidni ligand AF11154. Pripravljene bakteriofagne delce smo kot detekcijske sonde preizkusili tako, da smo na dno vdolbinic mikrotitrske ploščice imobilizirali EpoR ter v vdolbinice sočasno nanesli bakteriofage s predstavljenim peptidom in vzorec s krajšim peptidnim agonistom oz. rekombinantnim eritropoetinom (rhEPO), zatem pa spremljali kompeticijo za vezavo na imobiliziran EpoR. Prisoten rhEPO oz. agonist je pričakovano najučinkovitejše zaviral vezavo na receptor bakteriofagov, ki imajo na svoji površini predstavljen peptid AF11154. S kompetitivnim testom ELISA smo tudi ocenili območje sorazmernega zmanjšanja vezave bakteriofagov v odvisnosti od koncentracije prisotnega rhEPO v vzorcu, ki pa je višja, kot so fiziološke koncentracije rhEPO.[M. Jerman]20182018-03-22 07:59:33Magistrsko delo/naloga100323sl