Computational Design of 4-Azido-L-alanine-Incorporating Non-Ribosomal Peptide Synthetase

Dobrovoljc, Vid (avtor), Hribar Lee, Barbara (mentor)

Non-ribosomal peptidyl synthases (NRPS) are huge multimodular megaenzymes. Each of their modules incorporates one monomer, and that is how they synthesize a very diverse range of products in an assembly line fashion. The adenylation (A) domain was recognized very early on as a 'specificity guard' of the mechanism due to its role in the specific binding of monomers before their incorporation. Therefore, A domains have been of interest in the context of protein engineering since the discovery of NRPSs. Recent work by the host group has shown that with a single point mutation in the active site of an A domain, they can successfully incorporate 4-azido alanine into a peptide. However, since worse specificity and much lower production was observed than in the wild type, the aim of this work was to try to improve these properties by introducing multipoint mutations in the active site. In order to make this otherwise demanding task manageable, a new automated protocol was developed. In the first step, diverse and relatively stable candidates are generated using the FuncLib tool. In the next step, complexes with the monomer and cofactors are prepared for all the candidates and are evaluated according to the interaction energies. The most promising complexes are then simulated using molecular dynamics (MD) simulations, and a more detailed affinity analysis is then performed on the trajectory using the MMPBSA method. In this specific case, the vast majority of candidates showed a stable conformational dynamics, looking at the trajectories. Unfortunately, time ran out for a more detailed analysis with MMPBSA, and we are still waiting for the results of experimental testing.

• Jezik: Angleški jezik
• Ključne besede: Non-ribosomal peptidyl synthases, Computational design of multipoint active site mutants, FuncLib tool, MMPBSA method
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
• Leto izida: 2025
• PID: 20.500.12556/RUL-173776
• COBISS.SI-ID: 258820867
• Datum objave v RUL: 23.09.2025

Sekundarni jezik

• Jezik: Slovenski jezik
• Naslov: Računalniško načrtovanje neribosomalne peptidne sintetaze za vključevanje 4-azido-L-alanina

Izvleček

Neribosomalne peptidilne sintaze (NRPS) so ogromni multimodularni megaencimi. Vsak NRPS modul v rastočo verigo vgradi po en monomer, in tako se po principu tekočega traku sintetizirajo zelo raznoliki produkti. Adenilacijska (A) domena je bila zaradi svoje vloge pri specifični vezavi monomerov pred vgradnjo, že zelo zgodaj prepoznana kot 'specifičnostno varovalo' mehanizma. Tako so bile A domene že od samega odkritja NRPS zanimive v kontekstu proteinskega inženirstva. Nedavno delo gostujoče skupine je pokazalo, da lahko z enotočkovno mutacijo v aktivnem mestu A domene uspešno vključijo 4-azido alanin v peptid. Ker pa so pri sintezi opazili slabšo specifičnost in precej nižjo produkcijo kot pri divjem tipu, je bil cilj te naloge poskusiti izboljšati te lastnosti z uvedbo večtočkovnih mutacij v aktivnem mestu. Da bi ta sicer zelo zahtevna naloga postala bolj obladljiva, je bil razvit nov avtomatiziran protokol za načrtovanje in iskanje potencialnih kandidatov, ki bi izpolnjevali nalogo. V prvem koraku s pomočjo orodja FuncLib generiramo raznolike in relativno stabilne kandidate. V naslednjem koraku se vse za vse kandidate pripravi kompleske z monomerom in kofaktorji, ki se jih oceni glede na vrednosti interakcijskih energij. Najperspektivnejše komplekse se nato simulira s simulacijo molekulske dinamike (MD), na trajektorijah pa se nato izvede podrobnejša analiza afinitete z uporabo metode MMPBSA. V konkretnem primeru je glede na trajektorije velika večina kandidatov kazala stabilno konformacijsko dinamiko. Za podrobnejšo analizo z MMPBSA je žal zmanjkalo časa, pravtako pa še čakamo na rezultate eksperimentalnega testiranja.

• Ključne besede: Ne-ribosomalne peptidilne sintaze, Računalniško načrtovanje večtočkovnih mutacij v aktivnem mestu, orodje FuncLib, metoda MMPBSA