Izolacija adeno-asociacijskih virusov iz lizatov trajne celične kulture hek 293 s pomočjo monolitnih nosilcev

Primc, Viktorija (avtor), Narat, Mojca (mentor), Tajnik Sbaizero, Mojca (komentor)

V genski terapiji se za vnos genskega materiala uporabljajo virusni vektorji, med katerimi so rAAV eni najpogosteje uporabljenih. Z namenom izboljšanja njihovih lastnosti, kot sta tropizem in učinkovitost transdukcije, se s pomočjo genskega inženiringa nenehno razvijajo nove različice kapsid rAAV za uporabo v terapevtske namene. Ključno je doseči visok delež polnih vektorjev rAAV, ki vsebujejo terapevtske gene, na kar močno vpliva tudi postavitev ustreznih pogojev v pripravljalnih procesih. Zaradi lažjega spremljanja in izbire najbolj optimalnega serotipa rAAV in parametrov tekom pripravljalnih procesov obstaja potreba po razvoju hitrega, enostavnega in stroškovno učinkovitega protokola čiščenja virusnih vektorjev na majhni skali, ki bi imel možnost avtomatizacije in kasnejšega prehoda na industrijsko raven. V magistrskem delu smo preučevali različne korake protokola za izolacijo serotipov rAAV2, rAAV8, rAAV9. Določili smo delež, potreben za zakisanje celičnega lizata kulture HEK 293, definirali elucijski volumen virusa in določili kapaciteto oz. volumen nalaganja vzorca na monolitni nosilec ter testirali različne predpriprave lizatov HEK 293 tekom pripravljalnih procesov. Preučevali smo dva različna vezavno-elucijska pogoja, gradient pH in pH-NaCl, z namenom izboljšanja vezave rAAV na monolitne nosilce ter zmanjšanja količine nečistot v elucijskih frakcijah. Po posameznem koraku v procesu razvoja protokola smo naredili analizo količine produkta in čistosti vzorcev z različnimi analitskimi metodami: PATfix, masna fotometrija, BCA, Picogreen in SDS-PAGE. Protokol izolacije rAAV iz lizatov celičnih kultur HEK 293 se je izkazal za robustnejšega, ko smo za elucijski pogoj uporabili gradient pH-NaCl, saj smo z njegovo pomočjo uspešno očistili lizate vseh uporabljenih serotipov rAAV na monolitni mikrotitrski plošči CIM® SO3 0,2 mL s 96 luknjami. Z obema elucijskima pogojema nam je uspelo pridobiti vpogled v deleže polnih kapsid rAAV z uporabo masne fotometrije, ki zahteva določeno stopnjo čistosti in koncentracije virusov.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: rAAV, biotehnologija, genska terapija, masna fotometrija, monolit, ionsko izmenjevalna kromatografija, PATfix
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: BF - Biotehniška fakulteta
• Leto izida: 2025
• PID: 20.500.12556/RUL-170868
• COBISS.SI-ID: 243252227
• Datum objave v RUL: 19.07.2025

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Isolation of adeno-associated viruses from lysates of immortalised hek 293 cell culture using monolithic carriers

Izvleček

In gene therapy, viral vectors are used to deliver genetic material, with rAAV being among the most commonly employed. To improve their properties, such as tropism and transduction efficiency, new variants of rAAV capsids are continuously being developed through genetic engineering for therapeutic applications. A key objective is to achieve a high proportion of full rAAV vectors containing therapeutic genes, which is strongly influenced by the optimization of conditions during the upstream processing steps. In order to facilitate monitoring and selection of the most optimal rAAV serotype and parameters during the upstream processes, there is a need to develop a fast, simple and cost-effective protocol for the purification of viral vectors on a small scale, which would have the possibility of automation and subsequent transition to an industrial level. In the master's thesis, we studied the different steps of the protocol for the isolation of serotypes rAAV2, rAAV8, rAAV9. We determined the proportion required for acidification of HEK 293 cell lysate, defined the elution volume of the virus and determined the capacity or volume of sample loading on the monolithic carrier and tested different pre-treatments of HEK 293 lysates during the preparation processes. Two different elution conditions, pH and pH-NaCl gradient, were studied to improve rAAV binding to monolithic carriers and reduce the amount of impurities in the elution fractions. After each step in the protocol development process, we analyzed the product quantity and purity of the samples using different analytical methods: PATfix, mass photometry, BCA, Picogreen and SDS-PAGE. The rAAV isolation protocol from HEK 293 cell culture lysates proved to be more robust when a pH-NaCl gradient was used as the elution condition, as it successfully purified lysates of all rAAV serotypes used on a CIM® SO3 0.2 mL monolithic 96-well plate. With both elution conditions, we were able to determine the proportions of full rAAV capsids using mass photometry, which requires a certain degree of purity and concentration of viruses.

• Ključne besede: rAAV, biotechnology, gene therapy, mass photometry, monolith, ion exchange chromatography, PATfix