Miglustat (N-butil-deoksinojrimicin (slika 1)) je v Evropski uniji in Združenih državah Amerike
odobrena kemična spojina za zdravljenje redkih avtosomno recesivnih bolezni. Miglustat se
običajno kombinira z encimskim nadomestnim zdravljenjem ali se uporablja namesto njega kot
primarna aktivna spojina.
Ena izmed zanimivih aplikacij miglustata je njegova uporaba kot inhibitorja v večvalentnih
zdravilih. Večvalentno zdravilo je sestavljeno iz več kopij inhibitorja, ki so običajno s prožnim
povezovalcem pritrjene na osnovno strukturo. Ta zasnova omogoča nekovalentne interakcije več
molekul inhibitorja z različnimi vezavnimi mesti na receptorjih. V primerjavi z enovalentnimi
analogi lahko večvalentne spojine dosežejo višjo afiniteto, saj omogočajo hkratno vezavo na več
tarč, kar pogosto vodi v močnejše delovanje kot zgolj povečanje koncentracije enovalentnega
liganda.
Raziskovanje večvalentnih interakcij ter njihov fizikalno-kemijski opis ima pomemben vpliv na
različna področja, zlasti na farmacevtsko industrijo. Dimerna α-manozidaza fižola Jack (220 kDa)
je najbolj raziskani encim na tem področju. Ima dve vezavni mesti za miglustat, kar omogoča
večvalentno interakcijo. Strukturne študije encima v kompleksu z miglustatom so zagotovile
ključne informacije, ki služijo kot osnova za nadaljnje raziskave mehanizma večvalentne vezave.
Razvoj fizikalno-kemijskega opisa večvalentne inhibicije ni enostavna naloga. Potrebno je
opredeliti ključne vplive, da bi ustvarili ustrezen model. Nedavno je bil predlagan termodinamični
model za kompleks α-manozidaze z 36-valentnim ligandnim skeletom na osnovi DNJ. Predlagani
nesodelujoči model predvideva, da je vezava inhibitorjev na receptor neodvisna. Vendar ima ta
model več omejitev, saj ne upošteva elektrostatičnih interakcij, ki postajajo bolj izrazite z večjo
valenco kompleksa.
Pri pH 5,5 obstaja elektrostatska privlačnost med negativno nabitimi apo mesti α-manozidaze
in pozitivno nabitimi ostanki DNJ na večvalentnem skeletu (miglustat ima pKa 6,94). Pri pH 4 pa
protein postane pozitivno nabit, kar zmanjša ugodnost interakcij z ligandom. Eksperimentalno je
bilo dokazano, da se pri 12-valentnem ligandu ob znižanju pH z 5,5 na 4 inhibicijska moč zmanjša
za 400-krat, medtem ko se pri 4-valentnem ligandu zmanjša za 80-krat. To kaže, daelektrostatične interakcije bistveno vplivajo na inhibicijsko moč, predvsem pri višjevalentnih
ligandih.
Naboje kompleksa, liganda in receptorja je mogoče določiti s simulacijami s konstantnim pH.
Leta 2021 je bil v GROMACS uveden nov modul za simulacije s konstantnim pH, katerega
razvijalci trenutno prizadevajo za njegovo integracijo v osnovno kodo GROMACS. Koda še ni bila
popolnoma preizkušena, vendar temelji na dinamičnem pristopu lambda, ki je bil uveden leta
1996. Prejšnje različice niso bile široko sprejete zaradi slabega skaliranja glede na število
titracijskih mest, vendar si trenutna implementacija prizadeva rešiti te težave.
Ustrezni repozitorij in navodila so na voljo na GitLab strain (
https://gitlab.com/gromacs-
constantph/constantph), kjer je predstavljen modul za simulacijo s konstantnim pH v program
GROMACS. Modul se zdi zanimiv za preizkus na sistemu miglustat:α-manozidaza. Do sedaj je
bilo opravljenih več študij, ki prikazujejo potencial tega modula za simulacije proteinov,
nebioloških sistemov in podobnih aplikacij. Poleg tega je bilo pred kratkim objavljeno tudi orodje
pH builder, ki omogoča samodejno pripravo simulacij s konstantnim pH za GROMACS sisteme.
V skladu z navodili sta na voljo dva pristopa za izvedbo simulacij:
Enostavnejši način, primeren za simulacije proteinov s standardnimi titracijskimi
aminokislinami, ki so že implementirane v modulu za konstanten pH.
Bolj zahteven način, potreben, kadar titracijski ostanki niso vključeni v obstoječem modulu.
Glede na kristalno strukturo PDB ima preučevana α-manozidaza na vsaki podenoti dve
različni glikozilaciji, s katerima je potrebno dodatno delati, vendar se ne obravnavata kot titracijski
mesti. Ostali titracijski ostanki tega proteina so standardni in že podprti v modulu za konstanten
pH. Vendar pa večvalentni ligand, ki vsebuje DNJ skupine, zahteva dodatno obdelavo. Miglustat
mora zato prestati postopek parametrizacije, da bi bil primeren za simulacije s konstantnim pH.
Miglustat je iminosladkor, katerega strukturo določata dva ključna fenomena:
Njegove cikloheksanske lastnosti, ki povzročajo različne konformacije (npr. stol, čoln, zvit
čoln).
Struktura terciarnega amina, ki se podvrže "dežnikasti" oziroma piramidalni inverziji.
Oba pojava bistveno prispevata h konformacijskemu ansamblu miglustata. Zaradi dežnikaste
inverzije lahko protonacija miglustata vodi do nastanka dveh stereoizomerov (R in S). Ta vidik je
ključen za simulacijo s konstantnim pH, saj vpliva na konformacijski ansambel molekule.
V trenutni implementaciji GROMACS modula s konstantnim pH so vezani ligandi upoštevani
v protonirani in deprotonirani obliki za lambda delce. Ko enkrat izberemo protoniran izomer (R ali
S) miglustata, ta ostane nespremenjen skozi celotno simulacijo. Posledično ta pojav ni ujet v
običajnih simulacijah molekulske dinamike, kar pomeni, da smo omejeni na simulacijo ene
konformacijske oblike (R ali S).Cilji mojega magistrskega dela so naslednji:
1. Preizkusiti implementacijo na znanih modelnih sistemih.
2. Uporabiti simulacije s konstantnim pH za encim α-manozidazo Jack Bean in DNJ-
podobne ligande.
Za dosego teh ciljev je potrebno opraviti naslednje naloge:
● Namestitev GROMACS modula s podporo za konstanten pH.
● Izvedba preskusnih simulacij za tripeptid z asparaginsko kislino.
● Priprava encima za simulacije s konstantnim pH.
● Izračun naboja encima kot funkcija pH (v teku).
● Raziskava konformacijskih stanj in dežnikaste inverzije DNJ z uporabo kvantno-kemijskih
izračunov.
● Parametrizacija miglustata/DNJ-podobnih ligandov.
● Izvedba titracije za potrditev parametrov (v teku).
Testni primer Ala-Asp-Ala je deloval brez težav, uporabljen pa je bil standardni protokol.
Simulacije pri različnih vrednostih pH so dale pričakovano titracijsko krivuljo za asparaginsko
kislino. Pri simulacijah beljakovin pa je prišlo do napake že v prvem koraku, zaradi prisotnosti
glikanov
(
https://gitlab.com/gromacs-constantph/phbuilder).
Uporaba
našega
internega
protokola, ki smo ga razvili v sklopu magistrskega dela, je zagotovila uspešno rešitev in simulacije
pri različnih pH vrednostih so se začele izvajati. Naboj proteina pri pH=5 se ujema z
eksperimentalnimi podatki.
Pred začetkom parametrizacije miglustata je bilo treba izbrati enega izmed izomerov. Odločili
smo se za R-izomer DNJ, saj je ta oblika vezana na protein. Kvantno-kemijski izračuni so
pokazali, da je R-izomer v ekvatorialni konformaciji (Req) najbolj stabilen v raztopini, bistveno bolj
od S-izomernih konformacij (Sax, Seq).
Parametrizacija miglustata se je izkazala za zahtevno. Ni bilo mogoče doseči konvergence
za koeficiente polinoma, ki opisuje derivat korekcijskega potenciala. Verjetni razlog so visoke
energijske ovire med prehodi različnih konformacij obroča. Zato smo uporabili metodo AWH za
določitev korekcijskega potenciala, ki temelji na dveh dihedralnih kotih (glej Metode). Ta
pristranski potencial smo nato uporabili v postopku parametrizacije za prilagoditev korekcijskega
potenciala.Po štirih iteracijah smo končali postopek parametrizacije in dobili začetne koeficiente.
Namestitev specializirane kode za konstanten pH v GROMACS in phbuilder je bila uspešna.
Standardne proteine lahko simuliramo brez težav, težave pa nastanejo pri prisotnosti
nestandardnih ostankov, kot so glikani ali DNJ. Naše interno razvite metode so omogočile
uspešno rešitev teh težav. Preliminarni rezultati za encim Jack Bean α-manozidazo kažejo, da
simulacije s konstantnim pH nudijo razumno oceno izoelektrične točke. Kljub temu avtomatizacijaparametrizacije ostaja izziv pri kompleksnih sistemih, vendar je bila po rešitvi težav z vzorčenjem
parametrizacija uspešno zaključena.
