Odkrivanje mutacij po tarčnem preurejanju genoma zelja (Brassica oleracea var. capitata) z metodama qPCR in dPCR

Javornik, Žiga (avtor), Štajner, Nataša (mentor), Stajič, Ester (komentor)

Za genetsko preurejanje rastlin se danes najpogosteje uporablja sistem CRISPR/Cas9, ki nam omogoča tarčno preurejanje rastlinskih genov z visoko natančnostjo. CRISPR/Cas sistem je bil sprva odkrit pri bakterijah in arhejah, kjer vodilna RNA prepozna virusno DNA, in jo z endonukleazo razreže na manjše fragmente. Za preurejanje rastlinskega genoma je potrebno sintetizirati komplementarno gRNA zaporedje, ki se veže na gen, ki ga preurejamo. Tarčno preurejanje genov s CRISPR/Cas9 sistemom se uporablja za raziskovanje funkcije genov, preučevanje genske regulacije in razvoj rastlin z izboljšanimi lastnostmi. Ta metoda je tudi časovno in stroškovno učinkovitejša v primerjavi s tradicionalnimi tehnikami genske modifikacije. Po tarčnem preurejanju genoma potrebujemo hitro, enostavno, natančno in cenovno ugodno metodo, s katero lahko potrdimo uspešnost nastanka genetskih preureditev naših vzorcev. V okviru magistrske naloge smo vzpostavili metodi dPCR in qPCR za detekcijo mutacij po tarčnem preurejanju gena cenh3 s tehnologijo CRISPR/Cas9. Z metodo qPCR smo 75 % testiranim vzorcem uspešno potrdili nastanek induciranih mutacij po tarčnem preurejanju genoma, z metodo dPCR pa 89 % testiranim vzorcem. Deleže mutacij dobljenih z metodama qPCR in dPCR smo primerjali z rezultati NGS analize in ugotovili, da smo z metodo dPCR določili bolj primerljive odstotke mutacij kot z metodo qPCR. Na podlagi naših rezultatov bi lahko obe metodi uporabili za uspešno potrditev mutacij po tarčnem preurejanju genoma s CRISPR/Cas9 sistemom, s čimer bi znižali finančni in časovni vložek raziskav.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: CRISPR/Cas9, dPCR, qPCR, NGS, cenh3, haploidi
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: BF - Biotehniška fakulteta
• Leto izida: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-164116
• COBISS.SI-ID: 211959043
• Datum objave v RUL: 17.10.2024

JAVORNIK, Žiga, 2024, Odkrivanje mutacij po tarčnem preurejanju genoma zelja (Brassica oleracea var. capitata) z metodama qPCR in dPCR [na spletu]. Magistrsko delo. [Dostopano 4 maj 2025]. Pridobljeno s: https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?lang=slv&id=164116

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Detection of mutations after genome editing in cabbage (Brassica oleracea var. capitata) with qPCR and dPCR

Izvleček

CRISPR/Cas9 technology is a widely used method for precise genome editing in plants. The CRISPR/Cas system was originally discovered in bacteria and archaea, where the guide RNA recognizes viral DNA and breaks it down into smaller fragments using an endonuclease. For genome editing in plants, a complementary gRNA sequence must be synthesized that binds to the target gene. Targeted genome editing using CRISPR/Cas9 technology is used to investigate gene function, study gene regulation and develop plants with improved traits. This method is also more time and cost efficient than conventional genetic modification techniques. After targeted genome editing, a fast, simple, accurate and cost-effective method is required to confirm the successful occurrence of genetic changes in the samples. In this master thesis, we aimed to develop dPCR and qPCR methods for the detection of mutations after targeted editing of the cenh3 gene using CRISPR/Cas9 technology. Using the qPCR method, we successfully confirmed the presence of induced mutations in 75 % of the samples tested, while using the dPCR method we confirm mutations in 89 % of the samples. We compared the mutation percentages obtained with the qPCR and dPCR methods with the results of the NGS method and found that the dPCR method yields more comparable mutation percentages than the qPCR method. Based on our results, both methods can be used to successfully confirm mutations after targeted genome editing using the CRISPR/Cas9 system, reducing the financial and time burden of analysis.

• Ključne besede: CRISPR/Cas9, dPCR, qPCR, NGS, cenh3, haploids