Analitska občutljivost in specifičnost verižne reakcije s polimerazo za detekcijo mukormicetnih plesni

Koblar, Nuša (avtor), Matos, Tadeja (mentor)

Mukormikoze so angioinvazivne glivne okužbe, ki jih povzročajo mukormicete oziroma plesni reda Mucorales. Mukormikoza se pojavlja pri imunsko oslabljenih bolnikih, zanjo je značilno hitro napredovanje bolezni, slaba prognoza in visoka smrtnost. Hitra diagnoza mukormikoze izboljša izid in preživetje bolnikov. Laboratorijska diagnostika sloni na tradicionalnih mikrobioloških tehnikah kot so direktna mikroskopija, glivne kulture in histologija, ki pa imajo slabo občutljivost in zahtevajo izkušeno laboratorijsko osebje in kar je najpomembneje, do rezultatov pridemo šele po nekaj dneh inkubacije. Namen magistrske naloge je bil proučiti možnosti za dopolnitev klasičnega pristopa diagnostike mukormicetnih plesni z molekularno metodo multipleksne verižne reakcije s polimerazo (PCR) v realnem času z uporabo kompleta reagentov MucorGenius® Multiplex Real-Time PCR, zato smo preverili občutljivost in specifičnost te metode. V raziskavo smo vključili 9 askomicetnih in 11 mukormicetnih plesni. Pripravili smo suspenzijo sporangiofor posameznih plesni v koncentraciji z optično gostoto, ekvivalentno 0,5 po McFarlandovem standardu in v primeru mukormicetnih plesni suspenzijo redčili za faktor redčenja 10 do 107. Iz začetne suspenzije in vseh nadaljnjih redčitev (v primeru mukormicetnih plesni) smo izolirali DNA in izvedli multipleksni PCR v realnem času z uporabo kompleta reagentov MucorGenius®. Obenem smo za namen kvantifikacije vsako redčitev mukormicetnih plesni konfluentno nacepili na gojišče po Saboraudu za določitev koncentracije sporangiofor (CFU/ml). Za mukormicetne plesni Rhizopus microsporus, Mucor circinelloides in Lichtheimia corymbifera, smo iz najnižje, srednje in najvišje redčitve posamezne vrste, ki je še dala pozitiven rezultat, multipleksni PCR v realnem času ponovili še 12-krat. Po statistični analizi smo ugotovili, da je analitska občutljivost multipleksnega PCR v realnem času z uporabo kompleta reagentov MucorGenius® 91,7 %, analitska specifičnost pa 100 %. Menimo, da bi bila metoda multipleksnega PCR v realnem času z uporabo MucorGenius®, primerna za dopolnitev klasične diagnostike.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: glivne okužbe, mukormikoza, Mucorales, mikrobiološke metode, metoda multipleksne PCR v realnem času, diagnostika mukormikoze, MucorGenius®
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: BF - Biotehniška fakulteta
• Založnik: [N. Koblar]
• Leto izida: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-156464
• UDK: 616.992:57.083
• COBISS.SI-ID: 196704515
• Datum objave v RUL: 26.05.2024

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Analytical specificity and sensitivity of polymerase chain reaction assay for identification of Mucormycetes

Izvleček

Mucormycoses are angioinvasive fungal infections caused by mucormycetes, or fungi of the order Mucorales. Mucormycosis occurs in immunocompromised patients and is characterized by rapid disease progression, poor prognosis, and high mortality. Prompt diagnosis of mucormycosis improves patient outcomes and survival. Laboratory diagnostics rely on traditional microbiological techniques such as direct microscopy, fungal cultures, and histopathology, which have limited sensitivity and require experienced laboratory personnel. Most importantly, results are typically obtained only after several days of incubation. The aim of the master's thesis was to explore the potential for improving the conventional diagnostic approach to mucormycetous molds with a molecular method of real-time multiplex polymerase chain reaction (PCR) using the MucorGenius® Multiplex Real-Time PCR kit, and to assess the sensitivity and specificity of this method. The study included 9 ascomycetous and 11 mucormycetous molds. We prepared a sporangiophore suspension of each mold with an optical density equivalent to the 0.5 McFarland standard, and for the mucormycetous molds, we made dilutions from 101 to 107. DNA was isolated from the initial suspension and all subsequent dilutions (in the case of mucormycetous molds) and subjected to real-time multiplex PCR using the MucorGenius® kit. Concurrently, for quantification purposes, each dilution of mucormycetous molds was inoculated onto Sabouraud's medium to determine the concentration (CFU/ml). For mucormycetous mold species Rhizopus microsporus, Mucor circinelloides, and Lichtheimia corymbifera, real-time multiplex PCR was repeated 12 times for the lowest, medium, and highest dilutions of each species that still yielded a positive result. Statistical analysis revealed that the analytical sensitivity of real-time multiplex PCR using the MucorGenius® kit is 91.7%, and the analytical specificity is 100%. We believe that real-time multiplex PCR using MucorGenius® could be suitable for supplementing classical diagnostics.

• Ključne besede: fungal infections, mucormycosis, Mucorales, microbiological methods, method of real-time multiplex PCR, mucormycosis diagnostics, MucorGenius®