Validacija metode za izolacijo RNA iz tumorjev in prostocelične RNA iz plazme rakavih bolnikov

Kerin, Mirjam (avtor), Čemažar, Maja (mentor), Mesti, Tanja (komentor)

Melanom je oblika kožnega raka, ki nastane v melanocitih in pogosto zaseva, zato je vzrok za več kot 90 % vseh smrti zaradi kožnega raka. Najhitreje razvijajoče se in zelo uspešno zdravljenje malignega melanoma je imunoterapija z zaviralci imunskih kontrolnih točk (ZIKT). Za napovedovanje učinkovitosti terapije in odgovora na zdravljenje z ZIKT pa so zelo pomembni biomarkerji pri posameznem bolniku. V nalogi smo vzpostavili metodi za določanje izražanja dveh biomarkerjev pri bolnikih z malignim melanomom, in sicer IFNgama in PD-L1 iz plazme in iz rezin tumorskega tkiva, fiksiranega s formalinom in vklopljenega v parafin (FFPE tkivo). Ugotovili smo, da je za ugotavljanje izražanja genov v FFPE tkivu zelo pomembna ustrezna priprava FFPE tkiva, primerno shranjevanje vzorcev, izbira ustreznih metod za izolacijo RNA iz tkiva in prepis v cDNA ter izbor ustreznih hišnih genov pri verižni reakciji s polimerazo (PCR). Pri določanju izražanja biomarkerjev v krvni plazmi smo ugotovili, da je prostocelična RNA (cfRNA) v krvi prisotna vsaj tri dni po odvzemu krvi, če je le-ta skladiščena pri 5 °C, in da je verižna reakcija s polimerazo z revezno transkripcijo (RT-qPCR) z genskimi fragmenti gBlocks ustrezna metoda za dokazovanje cfRNA v krvi bolnikov z melanomom. CfRNA v plazmi je prisotna tako pri zdravem posamezniku kot pri bolniku z melanomom.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: melanom, imunoterapija, ZIKT, biomarkerji, IFNgama, PD-L1, RNA, FFPE tkivo, krvna plazma
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: BF - Biotehniška fakulteta
• Založnik: [M. Kerin]
• Leto izida: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-154487
• UDK: 616-006.81:575(043.2)
• COBISS.SI-ID: 186738947
• Datum objave v RUL: 17.02.2024

KERIN, Mirjam, 2024, Validacija metode za izolacijo RNA iz tumorjev in prostocelične RNA iz plazme rakavih bolnikov [na spletu]. Magistrsko delo. M. Kerin. [Dostopano 5 maj 2025]. Pridobljeno s: https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?lang=slv&id=154487

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Validation of a method for isolation of RNA from tumours and cell-free RNA from plasma of cancer patients

Izvleček

Malignant melanoma is a type of skin cancer that arises from melanocytes and often spreads to other organs – metastasizes, making it the major cause of death from skin cancer (more than 90% of all skin cancer-related deaths). The most rapidly developing and highly successful treatment for malignant melanoma is immunotherapy with immune checkpoint inhibitors (ICI). For predicting the effectiveness of therapy and the response to treatment with ICI, prognostic biomarkers are crucial. In this study, we established methods for determining the expression of two biomarkers in patients with malignant melanoma: IFNgama and PD-L1, from plasma and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections of tumor tissue. We found that for evaluating gene expression in FFPE tissue, proper preparation of FFPE tissue, appropriate storage of samples, selection of suitable methods for RNA isolation from tissue, transcription into cDNA, and the selection of appropriate housekeeping genes in polymerase chain reaction (PCR) are crucial. In determining the expression of biomarkers in blood plasma, we found that cell-free RNA (cfRNA) is present in the blood at least three days after blood collection if stored at 5°C, and that reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) with gene fragments gBlocks is an appropriate method for detecting cfRNA in the blood of melanoma patients. CfRNA in plasma is present in both healthy individuals and melanoma patients.

• Ključne besede: melanoma, immunotherapy, ICI, biomarkers, IFNgama, PD-L1, RNA, FFPE tissue, blood plasma