Gibanje pri ljudeh in drugih vretenčarjih je rezultat zapletenega mehanizma, ki vključuje na stotine natančno organiziranih in usklajenih celic skeletnih mišic. Primarna funkcija tako urejenega celičnega aparatusa, ki spada pod prečnoprogaste mišice, je ustvarjanje sile in krčenja za podporo dihanju, gibanju in drži. Mišična vlakna lahko primerjamo z veliko, večjedrno celico, imenovano miocit, ki nastane ob razvoju mišic s spajanjem več posameznih mišičnih celic. Za razvrščanje mišičnih vlaken se uporabljajo različni kriteriji, kot so barva (rdeča ali bela), kontraktilne lastnosti motoričnih enot po električni stimulaciji (podaljšana ali hitra kontrakcija), hitrost skrajšanja med enim samim trzanjem (hitro ali počasno trzanje), celični metabolizem (oksidativni ali glikolitičen). Ugotovljeno je bilo, da so te značilnosti mišičnih vlaken določene s prevlado počasne ali hitre težke verige miozina (MyHC). Štiri glavne izooblike MyHC v skeletnih mišicah sesalcev so MyHC I, specifične za počasne mišične celice, in IIa, IIx in IIb MyHC, specifične za hitre mišične celice. Ti dve vrsti mišičnih celic je mogoče ločiti pod mikroskopom glede na barvo: počasne celice so rdeče, medtem ko so hitre celice bolj bele barve zaradi svojih presnovnih poti. Vendar metode obarvanja, kot so imunohistokemija z uporabo monoklonskega protitelesa ali metoda metakromatskega barvila-ATPaze, zagotavljajo učinkovitejši postopek identifikacije. Študije so pokazale, da imajo sprinterji običajno večji delež hitrih mišičnih vlaken, medtem ko imajo vzdržljivostni športniki več počasnih mišičnih vlaken. To kaže na veliko strukturno in funkcionalno mišično raznolikost vsakega posameznika, ki je posledica variabilnosti sestave mišičnih vlaken – mišična prilagodljivost (angl. plasticity) je pojav, ki ga omogočajo vlakna tako, da spreminjajo svoje lastnosti kot odgovor na veliko različnih fizioloških dražljajev, med katerimi so najpomembnejši kalcijevi (Ca2+) ioni. Diferenciacija mišičnega tipa je močno odvisna od sistema za upravljanje Ca2+ - na Ca2+-občutljiva fosfataza kalcinevrin (CN) je, kot se izkaže, ključni regulator diferenciacije mišičnih vlaken, in je zato glavni objekt raziskave pričujoče magistrske naloge.
Poleg omenjene intenzivne vadbe, ki mišico krepi, oblikuje in nanjo pozitivno vpliva med rastjo, pa staranje in bolezni neprestano spremenijo kontraktilne lastnosti skeletnih mišic in jih šibijo. Kljub temu, pa te vztrajajo pri svojem neumornem krčenju in nam omogočajo gibanje vse življenje. Poglobljeno razumevanje naštetih mehanizmov, ki šibijo mišice in razlogov, zaradi katerih pride do negativnih sprememb, je vsekakor pomemben podvig, ki smo mu sledili v tej raziskavi, saj je na tem področju še veliko za odkriti. Predhodne strukturne in molekularne študije prečnoprogastih mišic so omogočile opazovanje podrobnosti osnovne organizacije proteinov, ki sestavljajo sarkomero, tj. primarno strukturno enoto, ki se vedno znova ponavlja skozi mišico. Sarkomera je osnovna kontraktilna enota progastih mišic, dolga 2-2,5 µm, in je običajno razdeljena na 4 cone, ki temeljijo na njeni aksialni ultrastrukturi: izotropni pas (I-band), kjer so prisotni le tanki (aktinski) filamenti, anizotropni pas (A-pas), ki vsebuje prekrivajoče se tanke aktinske in debele (miozinske) filamente, M-črta v središču, kjer se križno povezujejo samo miozinske niti in Z-disk, ki določa meje sosednjih sarkomer. Aktinski in miozinski filamenti sestavljajo sarkomerni citoskelet in drsijo drug mimo drugega v sarkomerah, da ustvarijo mišično kontrakcijo in dajo progastim mišicam njihov prepoznaven črtast videz izmeničnih temnih in svetlih pasov. Ta pravilna, vzporedna in ponavljajoča se narava sarkomernega citoskeleta omogoča ustvarjanje sile in gibanja le vzdolž osi filamenta in ojačitev preko milijonov sarkomer, ki delujejo usklajeno preko milimetrov ali celo centimetrov. Z-disk je točka srečanja med sosednjima sarkomerama, kjer sklop več kot 40 proteinov v tesnem sodelovanju usklajujejo sile in povzročajo nadzorovano, enosmerno krčenje, prenos napetosti med kontrakcijo, pa tudi zaznavanje in prenos informacij o biomehanskem stresu. Dodatno, antiparalelni konci aktinskih filamentov (F-aktin) so zasidrani na Z-disku. Dinamična in kompleksna struktura proteinov, ki sestavljajo sarkomere in Z-disk, je v stalnem spreminjanju za regeneracijo, hkrati pa zagotavlja visoko stabilnost in prožnost. Posledica nepravilnega delovanja katere koli komponente lahko povzroči bolezen, okvaro kontraktilnih enot ali na splošno povzroči fenotipska odstopanja. α-aktinin je na stiku sarkomer še posebej pomemben protein, saj ohranja celovitost Z-diska, medtem ko nadzoruje mehansko moč, ki nastane na sarkomeru. Posledično ni presenetljivo, da so mutacije v genih hActn1, hActn2 and hActn3 povezane z miopatijami in spremembami v diferenciaciji mišic. Polimorfizem prezgodnjega stop kodona (angl. premature stop codon polymorphism) v hActn3 se na primer pogosto pojavi pri ljudeh, vendar je α-aktinin-3 pogrešljiv in najpogostejši le v hitrih mišičnih vlaknih, zato se zdi, da posledice te mutacije niso preveč škodljive. Poleg tega pa se izkaže, da je α-aktinin-2 sposoben nadomestiti vlogo α-aktinina-3. Pomanjkanje α-aktinina-3 vpliva predvsem na diferenciacijo mišic in bilo je dokazano, da se ta genotip izraža v povečani vzdržljivosti pri športnikih. Pričujoča študija ponuja izhodišče in postavlja temelje za raziskovanje možnih mehanizmov, na katerih temelji sprememba celičnega fenotipa v primeru okvare hActn3. Raziskave kažejo, da ima proteinska fosfataza CN, ki je odvisna od kalcija in kalmodulina, ključno vlogo pri signalizaciji, ki nadzoruje tako srčno hipertrofijo kot tudi izražanje genov belih (počasnih) mišičnih vlaken in s tem diferenciacijo skeletnih mišic, ki jo nadzoruje genotip hActn3, preko CN/NFAT signalizacijske poti. Ko se CN aktivira s povečanjem koncentracije Ca2+ in je podvržen znatni konformacijski preureditvi, je sposoben defosforilirati NFAT v citoplazmi, kar vodi do premestitve NFAT v jedro. Tukaj se NFAT veže na DNA in uravnava transkripcijo več proteinov, povezanih s preoblikovanjem mišičnih vlaken, kot so počasni miozini, mioglobin in od MyoD odvisni ciljni geni.
Leta raziskav o načinih interakcije proteinov, kot so CN in NFAT, so omogočila preseči predstavo o strukturiranih domenah kot edinem funkcionalnem in molekularnem orodju evkariontskih organizmov. Sposobnost pridobitve podrobnejšega vpogleda v intrinzično neurejene regije proteinov je pokazala, da številne biomolekularne interakcije posredujejo kompaktni interakcijski vmesniki v teh regijah, ki se običajno imenujejo kratki linearni motivi (angl. short linear motifs, SLiMs). Dva glavna razreda, ki sta bila do sedaj identificirana, sta vezavni motivi, ki posredujejo interakcije s globularnimi domenami, in posttranslacijska modifikacijska mesta, ki jih prepoznajo in spremenijo različni encimi. Proteini, ki medsebojno delujejo s CN, vsebujejo SLiMe oz. kratke degenerirane peptidne sekvence, ki imajo ključno vlogo pri posredovanju dinamičnih interakcij protein-protein z nizko afiniteto med signalizacijo. Najbolj znana in najbolj ohranjena umestitvena površina na CN je hidrofobni žleb na strani nasproti aktivnega mesta, ki prepoznava motiv PxIxIT substratov, regulatorjev in sidrnih proteinov CN-a. Prav tako je bil LxVP prepoznan kot ohranjen motiv substratov CN, kritičen za njihovo defosforilacijo, in je najpogostejši sekundarni SLiM v povezavi s CN. Ugotovljeno je bilo, da peptidi, ki vsebujejo to zaporedje, specifično zavirajo interakcijo med NFAT in aktivirano obliko CN. Interakcijska površina zaporedja LxVP se nahaja v hidrofobnem žlebu, ustvarjenem na stiku med podenotama CN dimera. FATZ-1 (tudi kalsaricin-2 ali miozenin-1) je intrinzično neurejen protein, ki interagira s številnimi komponentami Z-diska, npr. z α-aktininom, in posledično deluje kot središče za interakcijo pomembnih proteinov in igra ključno vlogo pri genezi miofibrila. Poleg strukturne vloge proteinov FATZ kot središča za interakcije, ti opravljajo ključno vlogo v signalnih poteh z vezavo in zaviranjem CN. Izkaže se, da FATZ-1 veže in zavira akrivnost CN. Zanj posledično domnevamo, da ima pomembno vlogo pri regulaciji CN/NFAT signalne poti. V pričujoča študija postavlja temelje za razumevanje interakcijskih mehanizmov s katerimi FATZ proteini modulirajo sestavo vlaken skeletnih mišic in hipertrofijo srčne mišice. To dodaja plast pomembnosti vpletenosti FATZov v miofibrilogenezi, kjer zagotavljajo lokalizacijo signalizacije CN na sarkomeru.
Interakcije med proteini so ključne za večino bioloških procesov, ki posredujejo pri strukturni in funkcionalni regulaciji celic, zato smo v namen tega magistrkega dela prevzeli celovit pristop k razumevanju molekularnih mehanizmov regulacije CN preko interakcije s proteinom Z-diska skeletnih mišic FATZ-1. Naši encimski poskusi kažejo, da je FATZ-1 linearni kompetitivni zaviralec CN, s kombinacijo encimskih testov, poskusov vezave in strukturno analizo pa smo zožili vezavno mesto na C-terminalno regijo (angl. C-terminal region, CTR) FATZ-1. Razumevanje podrobnosti interakcije med CN in FATZ-1 lahko osvetli aktivacijo in regulacijo signalne poti CN, še posebej pa razkrije podrobnosti interakcije med proteinoma, saj kot ostali interaktorji CN, tudi FATZ-1 potrebuje enega izmed značilnih SLiMov, da izpolni svojo nalogo. Interaktom FATZ-1 razkriva, da sta vezavni mesti za α-aktinin-2 in CN tesno blizu na C-končni regiji FATZ-1, vendar je znano, da ima α-aktinin-2 visoko afiniteto vezave na FATZ-1, takšno, za katero domnevamo, da presega afiniteto CN za FATZ-1. Posledično je v središče postavljena možnost tekmovanja za vezavo na FATZ-1 med α-aktininom-2 in CN, kar bi pojasnilo preoblikovanje mišičnih vlaken zaradi povečane ravni prostih in aktivnosti CN. Zato v primeru pomanjkanja α-aktinina-3 po okvari hActn3, ko ga α-aktinin-2 nadomesti, zadnji lahko premaga CN za vezavo na FATZ-1, kar bi zaviralo CN in posledično motilo translokacijo NFAT v jedro. To bi vodilo do povečanja aktivnosti CN, kar spodbuja preoblikovanje skeletnih mišic proti počasnem fenotipu, ki mišici daje odpornost proti utrujenosti in poveča njeno vzdržljivost. Vendar je ta model celične diferenciacije, ki vključuje α-aktinin, FATZ-,1 in CN, izpeljan le iz opazovanj in vivo poskusov na miših z izbitim genom in fenotipa, ki ga izražajo. V pričujočem delu je predstavljeno izhodišče za podrobnejše razumevanje mehanizma diferencijacije skeletnih mišic, in vpletenosti vseh naštetih akterjev v tem procesu.
|
