Poskus direktnega določanja nukleotidnega zaporedja pomnožkov za določevanje črtne kode DNA škorpijonov

Tomšič, Jakob (avtor), Dolinar, Marko (mentor)

Metoda črtne kode DNA je širokospektralna metoda, ki se uporablja v taksonomiji, agronomiji, evolucijski biologiji itd. Temelji na identifikaciji živih in mrtvih organizmov na podlagi standardne regije, ki je značilna za posamezno skupino organizmov. Za večino živalskih vrst je določena črtna koda DNA na 5'-koncu gena za podenoto 1 citokrom c oksidaze. V Sloveniji imamo visoko biotsko raznovrstnost škorpijonov. Tu živijo predstavniki rodov Euscorpius in Alpiscorpius, ki jih najdemo po celotni državi, tudi v visokogorju. Po trenutni taksonomiji v Sloveniji živi deset ali enajst vrst škorpijonov. Nobena v Sloveniji prisotna vrsta ni nevarna človeškemu življenju. Izolirali smo škorpijonsko celokupno DNA in za pomnoževanje regije črtne kode DNA uporabljali Folmerjeva začetna oligonukleotida LCO1490 in HCO2198. V diplomskem delu smo optimizirati proces izolacije DNA iz škorpijonov, shranjenih v etanolu, da bi pridobili kakovostno DNA, ki bi omogočala uspešno pomnoževanja regije črtne kode. Pridobljenim pomnožkom smo tako lahko določili nukleotidno zaporedje direktno, brez predhodnega vstavljanja v vektor in kloniranja v bakterijskih celicah. Direktno smo določili nukleotidna zaporedja pomnožkov, ki pa niso bila škorpijonskega izvora, ampak so, zaradi verjetne okužbe vzorcev, pripadala sovkam rodu Chrysodeixis. Zaradi težav pri delu smo v nalogo vključili tudi preiskovanje virov teh neškorpijonskih zaporedij pri določanju črtne kode DNA in določili, da so vir okužbe najverjetneje skupni laboratorijski reagenti. Primerjali smo učinkovitosti uporabe dveh kompletov reagentov za izolacijo celokupne DNA in učinkovitost PCR-pomnoževanja z dvema paroma Folmerjevih začetnih oligonukleotidov. Ugotovili smo, da ima starost in hranjenje reagentov za izolacijo ter raztopine začetnih oligonukleotidov velik vpliv na uspešnost določevanja črtne kode DNA. Kot dodatek smo predstavili alternativo direktnemu določanju, ki vključuje kloniranje in določanje nukleotidnega zaporedja črtne kode DNA v izbranem vektorju. Kloniranim vključkom smo določili nukleotidno zaporedje in ponovno potrdili okužbo vzorcev z insektno DNA sovk.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: škorpijoni, črtna koda DNA, direktno določanje zaporedja PCR-produktov
• Vrsta gradiva: Diplomsko delo/naloga
• Tipologija: 2.11 - Diplomsko delo
• Organizacija: FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
• Leto izida: 2023
• PID: 20.500.12556/RUL-149387
• COBISS.SI-ID: 169053699
• Datum objave v RUL: 07.09.2023

TOMŠIČ, Jakob, 2023, Poskus direktnega določanja nukleotidnega zaporedja pomnožkov za določevanje črtne kode DNA škorpijonov [na spletu]. Diplomsko delo. [Dostopano 4 maj 2025]. Pridobljeno s: https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?lang=slv&id=149387

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Direct nucleotide sequencing attempt for amplicons representing scorpion DNA barcode

Izvleček

DNA barcoding is a broad-spectrum technique applicable in taxonomy, agronomy, evolutionary biology, and other fields. It is based on identifying living and deceased organisms through a standard region characteristic of a particular group of organisms. For most animal species the 5' end of the gene, encoding cytochrome c oxidase subunit 1, was selected as the barcoding region. Slovenia harbors a diverse range of scorpion species. Representatives of genera Euscorpius and Alpiscorpius inhabit the country, including high-altitude regions. According to current taxonomy, there are ten or eleven species present in Slovenia. None of the species found in Slovenia pose a threat to human life. We isolated total DNA from scorpions and used Folmer's universal primers, LCO1490 and HCO2198, to amplify the DNA barcode region. In this thesis, we aimed to optimize the DNA isolation process from ethanol-preserved scorpions to obtain high-quality DNA, enabling a successful amplification of the previously mentioned region. With these amplified fragments, we could directly determine the nucleotide sequence without prior vector ligation and bacterial cloning. We directly sequenced amplicons that were not of scorpion origin, but belonged to the owlet moth genus Chrysodeixis. This was likely a consequence of DNA contamination. Due to difficulties with isolation and direct sequencing, we also performed a comparison of the efficacy of two reagent kits for DNA isolation, an investigation of the source of non-scorpion sequences discovered whilst DNA barcoding, and an evaluation of the PCR amplification efficacy using two pairs of Folmer's universal primers. We have found that age and storage of reagents kits and primers have a significant impact on the success of determining the DNA barcode and that two PCR buffers that are frequently used in our lab are most likely sources of contamination, resulting in non-specific amplification. Furthermore, we presented an alternative to direct nucleotide sequencencing involving cloning, sequencing and determination of the DNA barcode within a selected vector. We determined the nucleotide sequence of inserts and once again confirmed the infection of the samples with insect DNA from owlet moths.

• Ključne besede: scorpions, DNA barcoding, direct sequencing of PCR products