Vpliv malih nekodirajočih RNA iz skupine YRNA in vtRNA na retrotranspozicijo LINE1

Novak, Valentina (avtor), Župunski, Vera (mentor)

LINE1 je avtonomni transpozicijski element iz skupine dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Njegove kopije sestavljajo približno 17 % človeškega genoma. Povečanje frekvence retrotranspozicije LINE1 je prisotno pri več patoloških stanjih, kot so rak ter nekatere avtoimunske in nevrološke bolezni. V procesu retrotranspozicije LINE1 sodeluje RNA vezavni protein ORF1p. YRNA in vaultRNA sta skupini malih nekodirajočih molekul RNA, katerih vloge še niso dobro poznane. Na podlagi rezultatov predhodne analize molekul RNA, ki se vežejo na ORF1p, smo v magistrski nalogi želeli ovrednotiti interakcijo človeških vaultRNA1-1 (vtRNA1-1) in RNY4 s proteinom ORF1p ter njun morebiten vpliv na retrotranspozicijo. Interakcijo endogenega ORF1p iz človeških celičnih linij 2102Ep in NTERA-2 s preiskovanima RNA smo najprej eksperimentalno potrdili s testom RNA-»pull down«. Za preučevanje vplivov v sesalskih celicah smo pripravili vektor pcDNA3.1-U6, ki vsebuje promotor U6 za vezavo RNA-polimeraze III. V pripravljeni vektor smo nato vstavili zapise za vtRNA1-1 in RNY4 ter ustreznost konstruktov za prekomerno izražanje danih RNA v celicah HeLa preverili z metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo po reverzni transkripciji (RT-qPCR). S pomočjo konstruktov smo preučili vpliv povečanja ravni vtRNA1-1 ali RNY4 na proces retrotranspozicije LINE1. Za ta namen smo uporabili test retrotranspozicije, kjer vključitev nove kopije retrotranspozona zaznamo preko reporterja EGFP (ojačan zeleni fluorescenčni protein) z meritvijo na pretočnem citometru. Test je pokazal, da povečanje koncentracije RNY4 zmanjša raven retrotranspozicije, medtem ko povečanje koncentracije vtRNA1-1 ni imelo signifikantnega vpliva. V zadnjem delu smo preučili še celično lokalizacijo proteina ORF1p in avtofagnega receptorja SQSTM1 (p62), na katerega po podatkih iz literature regulatorno vpliva vtRNA1-1. Kolokalizacije teh proteinov v celicah HEK 293T nismo zaznali, niti v pogojih oksidativnega stresa ali ob inhibiciji avtofagije. Rezultati prispevajo vpogled v RNA vezavne lastnosti proteina ORF1p in vplive nekodirajočih RNA na retrotranspozicijo LINE1.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: retrotranspozon LINE1, vaultRNA, YRNA
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
• Leto izida: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-128111
• COBISS.SI-ID: 70950659
• Datum objave v RUL: 02.07.2021

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Influence of small noncoding YRNAs and vtRNAs on retrotransposition of LINE1

Izvleček

LINE1 is an autonomous transposable element from the long interspersed nuclear element (LINE) family. Its copies account for approximately 17% of the human genome. Elevated levels of LINE1 retrotransposition are observed in different pathologies, such as cancer and some autoimmune and neurological diseases. An integral part of LINE1 retrotransposition machinery is the RNA-binding protein ORF1p. YRNA and vaultRNA are two groups of small non-coding RNA molecules with largely unknown functions. Based on previous results of ORF1p interacting RNAs, we wanted to evaluate the interaction of human vaultRNA1-1 (vtRNA1-1) and RNY4 with ORF1p and further discover their potential effects on retrotransposition. Interactions of endogenous ORF1p from 2102Ep and NTERA-2 cell lines with both non-coding RNAs were first experimentally confirmed by RNA pull-down assay. For overexpression studies in mammalian cells, we constructed pcDNA3.1-U6 vector, that has U6 promoter sequence for RNA polymerase III. We inserted vtRNA1-1 and RNY4 sequences into the vector and confirmed effectiveness of final constructs in HeLa cells with quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR). Constructs were then used for evaluation of effects of RNY4 or vtRNA1-1 overexpression on LINE1 retrotransposition. For this purpose, we used a retrotransposition assay, where new copies of the retrotransposon are counted by flow cytometry of EGFP (enhanced green fluorescent protein) reporter positive cells. We showed that overexpression of RNY4 lowers retrotransposition levels, while overexpression of vtRNA1-1 had no significant effect. In the last part, we explored cellular localisation of ORF1p and autophagy receptor protein SQSTM1 (p62), which was recently found to be regulated by vtRNA1-1. We did not observe colocalization of these two proteins in HEK 293T cells, even with induction of oxidative stress or autophagy inhibition. The results offer new insights into RNA-binding properties of ORF1p and on effects of non-coding RNA on retrotransposition of LINE1.

• Ključne besede: LINE1 retrotransposon, vaultRNA, YRNA