Iskanje novih zaviralcev bakterijske RNA polimeraze in silico

Kuret, Klara (avtor), Gobec, Stanislav (mentor), Salo-Ahen, Outi (komentor)

S porastom bakterijske rezistence v svetu narašča potreba po novih spojinah s protimikrobnim delovanjem. Rezistentne bakterije resno ogrožajo zdravje ljudi ter predstavljajo veliko ekonomsko breme obstoječemu zdravstvenemu sistemu. Pretok informacij v celici je ključen za njeno preživetje in funkcijo. Eden od procesov, ki omogoča prenos informacije na celičnem nivoju, je transkripcija DNA v RNA, ki jo katalizira encim RNA-polimeraza. Bakterijska RNA-polimeraza (RNAP) je zaradi svoje esencialne funkcije in specifičnosti ena od validiranih tarč za razvoj protibakterijskih učinkovin. Čeprav je danes znanih že več učinkovin, ki selektivno zavirajo delovanje RNAP, pa le manjšino uporabljamo v klinični praksi. Osrednji encim RNAP sestavlja pet podenot: dve α, β, β’ in ω. Podenoti β in β’ vršita katalitične in translokacijske korake sinteze RNA, medtem ko dimer α ter podenota ω sodelujejo pri pravilnem sestavljanju encima in regulaciji transkripcije. Zaradi svoje zapletene zgradbe ima RNAP mnogo alosteričnih mest, ki jih je možno ciljati z različnimi zaviralci. Do sedaj je opisanih šest glavnih mehanizmov zaviranja RNAP: 1 - zaviranje podaljševanja verige RNA preko blokade primarnega kanala, 2 - preprečitev sestavitve holoencima RNAP z zmanjšanjem afinitete jedra encima do podenote σ, ki je ključna za vezavo RNAP na promotor in iniciacijo transkripcije, 3 - kompetitivna inhibicija v aktivnem mestu encima z nukleozidnimi analogi, 4 - preprečitev katalize ter translokacijskih korakov sinteze RNA s stabilizacijo mobilnih elementov aktivnega mesta encima, 5 - blokada kanala za vstop substrata v aktivno mesto, 6 - inhibicija izomerizacije kompleksa RNAP-promotor iz zaprte v odprto konformacijo, ki je nujna za iniciacijo transkripcije. V sklopu magistrskega dela smo problem bakterijske rezistence naslovili z razvojem protokola virtualnega rešetanja za odkrivanje novih malih zaviralcev, ki se vežejo v aktivno mesto encima. Za razliko od alosteričnih mest je hitrost razvoja odpornosti proti zaviralcu v aktivnem mestu nižja, saj lahko substitucija ohranjenih aminokislinskih ostankov v aktivnem mestu povzroči izgubo ali zmanjšanje funkcije encima. Do sedaj je bil znan le en zaviralec, ki deluje na RNAP v aktivnem mestu – pseudouridimicin, in le-ta spada v skupino nukleozidnih analogov. Predstavljeni protokol za iskanje malih zaviralcev RNAP in silico za svoje delovanje uporablja metodo virtualnega rešetanja na osnovi strukture, ki je ena najpogosteje uporabljenih metod v procesu identifikacije spojin vodnic. Virtualno rešetanje na osnovi strukture primerja komplementarnost vsakega liganda iz knjižnice spojin z določenim tarčnim mestom. Pri tem algoritem molekulskega sidranja uporablja dvostopenjski proces, v katerem vsak ligand najprej prilega v tarčno mesto v množici različnih translacij, rotacij in nenazadnje konformacij, nato pa za vsako ustvarjeno pozo izračuna vrednost cenilne funkcije, ki opiše medmolekulske interakcije med pozo ter tarčnim mestom. Dostopna orodja za molekulsko sidranje uporabljajo različne cenilne funkcije in načine generiranja poz, zato je potrebno izbrati tisto, ki je najprimernejše našemu tarčnemu mestu. Z namenom izbora najustreznejšega orodja smo izvedli serijo poskusov molekulskega sidranja, v katerih smo ocenili tri različne algoritme glede na njihovo sposobnost reprodukcije poze pseudouridimicina znotraj lastne kristalne strukture (PDB ID: 5x21, ločljivost 3.323 Å). Orodje, ki je uspešno reproduciralo aktivno konformacijo pseudouridimicina in pravilno pozo uvrstilo med prve tri najbolje ocenjene poze, je bilo GOLD s cenilno funkcijo GoldScore. Vse izračunane poze v poskusu smo najprej ocenili vizualno, nato pa smo za vsako izračunali tudi vrednost Gibbsove proste vezavne energije s simulacijo MM-GBSA (Molecular Mechanics - Generalized Born Surface Area). Te vrednosti smo primerjali z izračunano vrednostjo Gibbsove proste vezavne energije za kristaliziran kompleks ligand-receptor, ki je služila kot kontrola. Poza, ki je uspešno posnemala vezavo kristaliziranega liganda, je imela najnižjo izračunano vrednost Gibbsove proste vezavne energije, kar kaže na energijsko ugodnost vezave in uporabnost MM-GBSA pri izbiri poz, ki izkazujejo potencial za uspešno vezavo. Po izbiri orodja za molekulsko sidranje smo pripravili tri različne knjižnice ligandov: dve iz zbirke komercialno dostopnih spojin MolPort ter knjižnico spojin iz podatkovne zbirke PubChem, ki izkazujejo podobnost pseudourudumicinu na osnovi Tanimotovega koeficienta. Nato smo izbrali tarče za sidranje. Ker aktivno mesto RNAP tekom procesa dodajanja nukleotida na rastočo RNA verigo zavzema različne konformacije, smo pred izbiro tarče preučili več dostopnih kristalnih struktur RNAP in se odločili, da bomo rešetanje izvedli na zaprtem aktivnem mestu in na pol-odprtem aktivnem mestu encima. Izbrani tarčni molekuli smo še dodatno oblikovali s postopki molekulskega modeliranja, da sta bolje predstavljali aktivno mesto encima tekom elongacijske faze transkripcije. Nato smo sistematično izvedli virtualno rešetanje pripravljenih knjižnic na izbranih tarčah. V presejalnem protokolu smo v prvi stopnji rešetanja uporabili GLIDE zaradi visoke hitrosti presejanja, v naslednjih stopnjah pa GOLD skupaj s cenilno funkcijo GoldScore. Po virtualnem rešetanju smo iz vsakega poskusa izbrali podskupino najbolje ocenjenih poz, na katerih smo s simulacijo MM-GBSA izračunali še vrednost Gibbsove proste vezavne energije za kompleks receptor-ligand. Poze, ki so v kompleksu s tarčnim vezavnim mestom izkazovale dovolj nizko prosto Gibbsovo vezavno energijo, smo vizualno preverili in izmed >100 najbolje ocenjenih spojin iz virtualnega rešetanja izbrali sedem kandidatov za testiranje in vitro z uporabo transkripcijsko-elongacijskega kompleksa. Dve testirani spojini sta in vitro izkazali šibko zaviralno aktivnost do RNAP v elongacijski fazi transkripcije, ena spojina – deltarasin, pa je izkazovala visoko zaviralno aktivnost. Zaviralna aktivnost spojin se je kazala v manjši učinkovitosti transkripcije oz. v popolni blokadi transkripcije pri deltarasinu. Vsi trije identificirani zaviralci vsebujejo heterociklični aromatski sistem, podoben purinskim bazam, ki tvori interakcije π-π in vodikove vezi z bazami nukleinskih kislin, prisotnih v aktivnem mestu. Pri deltarasinu smo poleg aromatičnega sistema opazili še dodatno podobnosti z vezavo pseudouridimicina. Obe spojini vsebujeta pozitivno nabit fragment, zmožen tvoriti ionske interakcije z negativno nabito fosfatno skupino na rastoči RNA verigi. S porastom števila odkritih spojin, ki delujejo v aktivnem mestu RNAP, se veča tudi izbor potencialnih kandidatov za razvoj novih protibakterijskih terapij. Iz primerjave strukture znanih zaviralcev lahko ugotovimo, kateri fragmenti so ključni za vezavo in aktivnost spojin, ter v skladu z novimi spoznanji inteligentno optimiziramo tako farmakološke, kot tudi farmakodinamične lastnosti spojin vodnic.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: bakterijska RNA-polimeraza, računalniško načrtovanje novih učinkovin na osnovi strukture, antibiotiki, protibakterijske učinkovine, zaviralec
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2020
• PID: 20.500.12556/RUL-116985
• Datum objave v RUL: 18.06.2020

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: In silico search for novel bacterial RNA polymerase inhibitors

Izvleček

The urge for novel antibiotics is rising due to an alarming increase in the number of antibiotic-resistant bacteria, occurring worldwide. Drug-resistant pathogens are not only a threat to our health but also pose a substantial economic burden to the healthcare systems. The bacterial RNA polymerase is already a validated target for clinical antibiotics, but although many compounds are known to inhibit it, only a few are currently used in clinical practice. This work focused on the development of a virtual screening pipeline for the discovery of novel bacterial RNA polymerase inhibitors that target the enzyme’s active site. The screening pipeline utilized GOLD and GLIDE docking tools, combined with MM-GBSA re-scoring of the top-scored ligand-receptor complexes, to determine candidate compounds for in vitro assays. Seven compounds were tested in vitro, using the recombinant transcription-elongation complex. Two tested compounds showed mild inhibitory activity towards the RNA polymerase and one compound – deltarasin, was found to have high inhibitory activity against the enzyme. Until now, only one compound - pseudouridimycin, belonging to the nucleoside analog class, was known to inhibit bacterial RNAP through binding to the enzyme’s active site.

• Ključne besede: bacterial RNA polymerase, structure-based drug design, antibiotic, anti-bacterial agents, inhibitor