Področje izdelave, vrednotenja in uporabe nanodelcev na osnovi kopolimera mlečne in glikolne kisline se je v preteklih 40 letih močno razvilo, saj so le-ti izkazali velik potencial za uporabo v biomedicini za dostavo zdravilnih učinkovin, diagnostikov in teranostikov. Med njihove številne prednosti med drugim spadajo: (i) biorazgradljivost in biokompatibilnost, (ii) ustaljene metode priprave, (iii) uporaba za dostavo različnih vrst zdravilnih učinkovin (hidrofobnih in hidrofilnih majhnih molekul, biomakromolekul), (iv) možnost dostave dveh učinkovin hkrati, (v) stabilizacija vgrajene učinkovine in njena zaščita pred prehitro razgradnjo (encimi, hidroliza), (vi) možnost nadzora sproščanja vgrajene učinkovine, (vii) možnost ciljane dostave učinkovin in (viii) številne možnosti funkcionalizacije površine delcev. Kljub številnim prednostim imajo takšni nanodelci določene pomanjkljivosti, ki še preprečujejo njihov prehod iz faze raziskav v klinično prakso. Med drugimi so to: (i) majhna kapaciteta za vgrajevanje učinkovin, (ii) hitra sprostitev velikega deleža vgrajene učinkovine (ang. initial burst release), (iii) omejena stabilnost disperzij nanodelcev, (iv) vprašljiva ponovljivost izdelave, (v) visoki stroški prenosa izdelave na proizvodno skalo in (vi) pomanjkljivo znanje o vplivu vseh procesnih parametrov na lastnosti pripravljenih nanodelcev.
Namen magistrskega dela je bil razviti metodo izdelave površinsko (ne)funkcionaliziranih nanodelcev, ki bo zagotavljala ponovljivost izdelave ter izvesti podrobno vrednotenje pripravljenih nanodelcev. Izbrana metoda priprave nanodelcev na osnovi kopolimera mlečne in glikolne kisline je temeljila na emulzijsko-difuzijski metodi z odparevanjem topila. Pripravljene nefunkcionalizirane in s hitosanom oz. polietileniminom funkcionalizirane nanodelce smo ovrednotili z vidika njihove hidrodinamske velikosti in porazdelitve velikosti delcev (fotonska korelacijska spektroskopija), površinskega naboja (laserska Dopplerjeva anemometrija), hidrofobnosti površine (modificirana metoda z barvilom Rose Bengal), morfologije (vrstična elektronska mikroskopija), kristaliničnosti (diferenčna dinamična kalorimetrija) in interakcij s celicami in vitro (celična linija TR 146). Poleg tega smo ovrednotili tudi reološke lastnosti disperzij nanodelcev. Pripravljene disperzije nanodelcev smo posušili z zamrzovanjem in izvedli dvomesečno stabilnostno študijo pri 2-8 °C.
Povprečna velikost nanodelcev z nefunkcionalizirano površino je bila ~230 nm in njihov zeta potencial ~-5 mV. V primerjavi z njimi so bili nanodelci s funkcionalizirano površino večji in so imeli pozitiven površinski naboj. Povprečna velikost nanodelcev, ki so bili funkcionalizirani s hitosanom, je bila ~325 nm in njihov zeta potencial ~+30 mV, medtem ko je bila velikost nanodelcev funkcionaliziranih s polietileniminom ~265 nm in njihov zeta potencial ~+10 mV. Nanodelci so bili v disperziji torej prekriti s približno 95 nm debelim hitosanskim oz. 35 nm debelim polietileniminskim plaščem, ki sta rahlo negativen začetni površinski naboj spremenila v pozitivnega. Polidisperzni indeks vseh končnih formulacij nanodelcev je bil manjši od 0,25. Pripravljene disperzije nanodelcev smo posušili z zamrzovanjem brez uporabe dodatnih pomožnih snovi. Posušene formulacije s hitosanom funkcionaliziranih nanodelcev se ni dalo uspešno redispergirati, medtem ko so bili povprečna velikost nanodelcev, njihova polidisperznost in zeta potencial preostalih dveh formulacij po redispergiranju liofilizata praktično nespremenjeni glede na njihove lastnosti pred sušenjem z zamrzovanjem. Vsi liofilizirani vzorci so bili stabilni (z ozirom na hidrodinamsko velikost, širino porazdelitve velikosti in površinski naboj po redispergiranju) dva meseca pri temperaturi 2-8 °C . Metoda določanja površinske hidrofobnosti je pokazala, da so bili najbolj hidrofobni nanodelci z nefunkcionalizirano površino, sledili so jim s polietileniminom funkcionalizirani in nato s hitosanom funkcionalizirani nanodelci. Osnovni kopolimer mlečne in glikolne kisline je bil manj hidrofoben v primerjavi z nanodelci. Modificiran protokol z barvilom Rose Bengal se je izkazal kot ustrezen za vrednotenje hidrofobnih (in rahlo hidrofilnih) površin oz. materialov, medtem ko ni bil ustrezen za vrednotenje izrazito hidrofilnih površin oz. materialov (npr. hitosana in polietilenimina). Zaradi premika absorpcijskega maksimuma uporabljenega barvila k višjim valovnim dolžinam ob prisotnosti hitosana ali polietilenimina, smo pri določanju hidrofobnosti uvedli dodaten korekcijski faktor, ki se je izkazal kot ustrezna rešitev za izračun končnih rezultatov preskusa. Reološke meritve kinematične viskoznosti in strižnega modula disperzij nanodelcev, ki smo jih primerjali z meritvami disperzij nanodelcev s funkcionalizirano površino in odgovarjajočih raztopin polimerov (hitosana ali polietilenimina), so pokazale, da se viskoznost disperzije s hitosanom funkcionaliziranih nanodelcev razlikuje od viskoznosti raztopine hitosana, medtem ko se viskoznost s polietileniminom funkcionaliziranih nanodelcev od viskoznosti raztopine polietilenimina občutno ne razlikuje. Na slikah, posnetih z vrstičnim elektronskim mikroskopom, smo opazili mostičke med nanodelci. Le-ti so bili najbolj opazni pri s hitosanom funkcionaliziranih nanodelcih, ki so bili na sliki enakomerno razporejeni, medtem ko te pravilne ureditve ni bilo vidne pri ostalih dveh vzorcih nanodelcev. Velikost nanodelcev na mikroskopskih slikah je bila rahlo manjša od tiste, določene s fotonsko lasersko spektroskopijo, opazili pa smo tudi porozne strukture velikosti ~300-400 nm v vzorcu s polietileniminom funkcionaliziranih nanodelcev, ki bi glede na dodatne eksperimente lahko bile posledica samozdruževanja presežnega polietilenimina in stabilizatorja v vodni fazi. Pri termični analizi smo opazili, da so imele vse formulacije nanodelcev podoben endotermni vrh, ki pa je bil pri rahlo nižji temperaturi kot vrh čistega kopolimera mlečne in glikolne kisline, kar je najbrž posledica zmanjšanja velikosti delcev v nano-območje in primesi drugih polimerov, ki smo jih uporabili pri pripravi nanodelcev. Negativno nabiti nanodelci so v velikem obsegu prešli v notranjost celic, medtem ko so pozitivno nabiti tvorili interakcije s celično membrano in so v celice vstopili v manjšem obsegu. S hitosanom funkcionalizirani nanodelci so se značilno adsorbirali na celično membrano, medtem ko je bilo adsorbiranih delcev v primeru s polietileniminom funkcionaliziranih nanodelcev na celični membrani malo.
V okviru magistrske naloge smo uspešno razvili protokol za pripravo nefunkcionaliziranih in s hitosanom funkcionaliziranih nanodelcev na osnovi kopolimera mlečne in glikolne kisline, medtem ko končna metoda izdelave s polietileniminom funkcionaliziranih nanodelcev ni omogočila želene funkcionalizacije nanodelcev. Lastnosti s polietileniminom funkcionaliziranih nanodelcev so bile podobne lastnostim nefunkcionaliziranih nanodelcev (podobna hidrodinamska velikost, relativno velika hidrofobnost površine, podobna morfologija nanodelcev). Na osnovi preostalih rezultatov tj. podobnih reoloških lastnosti disperzije z raztopino polietilenimina in manj izrazitih interakcij s celičnimi membranami v primerjavi s hitosanom funkcionaliziranimi nanodelci lahko zaključimo, da je bila priprava s polietileniminom funkcionaliziranih nanodelcev manj uspešna. V prihodnje bi bilo zato vsekakor treba optimizirati metodo izdelave s polietileniminom funkcionaliziranih nanodelcev ter proučiti uporabnost dodatnih pomožnih snovi (lio- in/ali krioprotektantov) v procesu sušenja s hitosanom funkcionaliziranih nanodelcev, ki bi omogočile učinkovito redispergiranje po sušenju z zamrzovanjem. V prihodnosti bi bilo treba izvesti še druge raziskave, ki bi lahko omogočile prehod pripravljenih formulacij nanodelcev iz raziskav v klinično prakso. Med drugim bi bilo treba izvesti raziskave stabilnosti pri različnih pogojih in v različnih oblikah (npr. liofilizati, disperzije nanodelcev,…), določiti kapaciteto za vgrajevanje zdravilnih učinkovin, ovrednotiti profil sproščanja vgrajene zdravilne učinkovine, izvesti dodatne raziskave interakcij z drugimi vrstami celic, proučiti njihovo obnašanje in vivo in določiti potencialne lastnosti prodiranja skozi mukus pripravljenih nanodelcev s funkcionalizirano površino.
|
