MATHEMATICAL MODELING OF MOLECULAR TRANSMEMBRANE TRANSPORT AND CHANGES OF TISSUES´ DIELECTRIC PROPERTIES DUE TO ELECTROPORATION

DERMOL-ČERNE, JANJA (avtor), Miklavčič, Damijan (mentor), Serša, Gregor (komentor)

Electroporation is a phenomenon, which occurs when short high voltage pulses are applied to cells and tissues resulting in a transient increase in membrane permeability or cell death, presumably due to pore formation. If cells recover after pulse application, this is reversible electroporation. If cells die, this is irreversible electroporation. Electroporation is used in biotechnology for biocompound extraction and cryopreservation, in food processing for sterilization and pasteurization of liquid food and in medicine for treating tumors by electrochemotherapy or irreversible electroporation as an ablation technique, for gene electrotransfer, transdermal drug delivery, DNA vaccination, and cell fusion. In electroporation-based medical treatments, we can treat tumors with predefined electrode geometry and parameters of electric pulses. When we treat larger tumors of irregular shape treatment plan of the position of the electrodes and parameters of the electric pulses has to be calculated before each treatment to assure coverage of the tumor with a sufficient electric field. In treatment plans, currently, 1) we assume that above an experimentally determined critical electric field all cells are affected and below not, although, in reality, the transition between non-electroporated and electroporated state is continuous. 2) We do not take into account the excitability of some tissues. 3) The increase in tissues’ conductivity is described phenomenologically and does not include mechanisms of electroporation. 4) Transport of chemotherapeutics into the tumor cells in electrochemotherapy treatments is not included in the treatment plan although it is vital for a successful treatment. We focused on the mathematical and numerical models of electroporation with the aim of including them in the treatment planning of electroporation-based medical treatments. We aimed to model processes happening during electroporation of tissues, relevant in the clinical procedures, by taking into account processes happening at the single cell level. First, we used mathematical models of cell membrane permeability and cell death which are phenomenological descriptions of experimental data. The models were chosen on the basis of the best fit with the experimental data. However, they did not include mechanisms of electroporation, and their transferability to tissues was questionable. We modeled time dynamics of dye uptake due to increased cell membrane permeability in several electroporation buffers with regard to the electrosensitization, i.e., delayed hypersensitivity to electric pulses caused by pretreating cells with electric pulses. We also modeled the strength-duration depolarization curve and cell membrane permeability curve of excitable and non-excitable cell lines which could be used to optimize pulse parameters to achieve maximal drug uptake at minimal tissue excitation. Second, we modeled change in dielectric properties of tissues during electroporation. Model of change in dielectric properties of tissues was built for skin and validated with current-voltage measurements. Dielectric properties of separate layers of skin before electroporation were determined by taking into account geometric and dielectric properties of single cells, i.e., keratinocytes, corneocytes. Dielectric properties of separate layers during electroporation were obtained from cell-level models of pore formation on single cells of lower skin layers (keratinocytes in epidermis and lipid spheres in papillary dermis) and local transport region formation in the stratum corneum. Current-voltage measurements of long low-voltage pulses were accurately described taking into account local transport region formation, pore formation in the cells of lower layers and electrode polarization. Voltage measurements of short high-voltage pulses were also accurately described in a similar way as with long low-voltage pulses; however, the model underestimated the current, probably due to electrochemical reactions taking place at the electrode-electrolyte interface. Third, we modeled the transport of chemotherapeutics during electrochemotherapy in vivo. In electrochemotherapy treatments, transport of chemotherapeutics in sufficient amounts into the cell is vital for a successful treatment. We performed experiments in vitro and measured the intracellular platinum mass as a function of pulse number and electric field by inductively coupled plasma – mass spectrometry. Using the dualporosity model, we calculated the in vitro permeability coefficient as a function of electric field and number of applied pulses. The in vitro determined permeability coefficient was then used in the numerical model of mouse melanoma tumor to describe the transport of cisplatin to the tumor cells. We took into account the differences in the transport of cisplatin in vitro and in vivo caused by the decreased mobility of molecules and decreased membrane area available for the uptake in vivo due to the high volume fraction of cells, the presence of cell matrix and close cell connections. Our model accurately described the experimental results obtained in electrochemotherapy of tumors and could be used to predict the efficiency of electrochemotherapy in vitro thus reducing the number of needed animal experiments. In the thesis, we connected the models at the cell level to the models at the tissue level with respect to cell membrane permeability and depolarization, cell death, change in dielectric properties and transport. Our models offer a step forward in modeling and understanding electroporation at the tissue level. In future, our models could be used to improve treatment planning of electroporation-based medical treatments.

• Jezik: Angleški jezik
• Ključne besede: Electroporation, multiscale modeling, excitable cells, predictive models, electrochemotherapy, numerical modeling, irreversible electroporation
• Vrsta gradiva: Doktorsko delo/naloga
• Organizacija: FE - Fakulteta za elektrotehniko
• Leto izida: 2018
• PID: 20.500.12556/RUL-101263
• Datum objave v RUL: 18.05.2018

Sekundarni jezik

• Jezik: Slovenski jezik
• Naslov: MATEMATIČNO MODELIRANJE SPREMEMB ELEKTRIČNIH LASTNOSTI TKIV IN TRANSPORTA PREKO CELIČNE MEMBRANE PRI ELEKTROPORACIJI

Izvleček

Visokonapetostni električni pulzi povečajo prepustnost celične membrane (Tsong 1991; Weaver 1993; Kotnik et al. 2012) skozi pore (Abidor et al. 1979), ki nastanejo na tistih njenih delih, kjer vsiljena transmembranska napetost preseže kritično vrednost (Towhidi et al. 2008; Kotnik et al. 2010). Elektroporacija je reverzibilna, če si celica po pulzih opomore, in ireverzibilna, če je škoda preobsežna in celica odmre (Pakhomova et al. 2013b; Jiang et al. 2015a). Trenutne optične metode por ne morejo zaznati, zato njihov nastanek zaznavamo posredno, bodisi z meritvami vnosa različnih molekul v celice ali z meritvami električnih lastnosti celic (Napotnik in Miklavčič 2017). Uporaba elektroporacije V živilski industriji (Toepfl 2012; Toepfl et al. 2014) uporabljamo elektroporacijo oziroma pulzirajoča električna polja (angl. pulsed electric fields), kar je uveljavljen izraz v tej industriji, za uničevanje patogenih organizmov in njihovih produktov (encimov in toksinov). V nasprotju s termično obdelavo hrane električni pulzi ne vplivajo na okus, barvo ali hranilno vrednost. V biotehnologiji uporabljamo elektroporacijo za ekstrakcijo molekul iz mikroorganizmov in rastlin, s čimer se izognemo uporabi kemičnih sredstev in ne uničimo celičnih organelov, torej se izognemo tudi dodatnemu čiščenju končnega produkta (Sack et al. 2010; Haberl et al. 2013a; Mahnič-Kalamiza et al. 2014b; Kotnik et al. 2015). Primeri: ekstrakcija DNK iz bakterij; sladkorja iz sladkorne pese (Haberl et al. 2013b), sokov iz sadja; polifenolov iz grozdja za izboljšanje kvalitete vina (Puértolas et al. 2010); vode pri sušenju zelene biomase, ki služi kot vir za biogorivo (Golberg et al. 2016). Elektroporacija je tudi nova metoda pri zamrzovanju celic in tkiv, angl. cryopreservation (Galindo in Dymek 2016; Dovgan et al. 2017). Elektroporacijo uporabljamo tudi v medicini (Miklavčič et al. 2010; Yarmush et al. 2014), in sicer pri elektrokemoterapiji (Miklavčič et al. 2012; Mali et al. 2013; Cadossi et al. 2014; Miklavčič et al. 2014; Campana et al. 2014; Serša et al. 2015), netermičnem odstranjevanju tkiva z ireverzibilno elektroporacijo (Davalos et al. 2005; Garcia et al. 2010; José et al. 2012; Cannon et al. 2013; Scheffer et al. 2014b; Jiang et al. 2015a; Rossmeisl et al. 2015), genski terapiji (Golzio et al. 2002; Vasan et al. 2011; Gothelf in Gehl 2012; Calvet et al. 2014; Heller in Heller 2015; Trimble et al. 2015) in vnosu učinkovin v kožo in skoznjo (Denet et al. 2004; Zorec et al. 2013b). Pri genski terapiji vnesemo v celice plazmide, v katerih je zapisana sinteza določenega proteina, ki lahko spremeni biološko funkcijo celice (Aihara in Miyazaki 1998; Heller in Heller 2015). Z elektroporacijo povišamo varnost genske terapije, saj se izognemo uporabi virusov in kemikalij. Mehanizmi genske terapije z elektroporacijo še niso popolnoma pojasnjeni, osnovni koraki so opisani v literaturi (Rosazza et al. 2016). Z elektroporacijo lahko zlivamo različne celice, s čimer pridobivamo celice, ki proizvajajo monoklonska protitelesa ali inzulin (Ramos in Teissié 2000; Trontelj et al. 2008; Rems et al. 2013). V doktorski disertaciji sem se osredotočila na uporabo elektroporacije v medicini, predvsem pri elektrokemoterapiji, netermičnem odstranjevanju tkiva z ireverzibilno elektroporacijo in pri vnosu učinkovin v kožo in skoznjo je, zato so ti trije posegi podrobneje opisani v naslednjem poglavju. Medicinski posegi z elektroporacijo – elektrokemoterapija, netermično odstranjevanje tkiva z ireverzibilno elektroporacijo in vnos učinkovin v kožo in skoznjo Elektrokemoterapija je kombinacija kemoterapije in električnih pulzov, dovedenih neposredno na tarčno tkivo. Električni pulzi povečajo prepustnost celične membrane za kemoterapevtike, zato povečamo učinkovitost zdravljenja, obenem pa zmanjšamo dovedeno dozo kemoterapevtika in omilimo stranske učinke. Celoten tumor mora biti pokrit z dovolj visokim električnim poljem, da povečamo prepustnost vseh tumorskih celic (Miklavčič et al. 2006a), zagotoviti pa moramo tudi dovolj visoko koncentracijo kemoterapevtika znotraj tumorja (Miklavčič et al. 2014). Okoliško tkivo ne sme biti uničeno, torej mora biti električno polje okoli tumorja pod mejo za ireverzibilno elektroporacijo. Pri elektrokemoterapiji običajno dovajamo osem pulzov dolžine 100 μs s ponavljalno frekvenco 1 Hz. S poskusi določena meja za povišanje prepustnosti tumorskega tkiva je 0,4 kV/cm (Miklavčič et al. 2010). Osem pulzov je bilo določenih kot optimalno število pulzov (Marty et al. 2006; Mir et al. 2006), večje število dovedenih pulzov namreč že zmanjšuje preživetje (Dermol in Miklavčič 2015). Za zdravljenje tumorjev z elektrokemoterapijo so bili definirani standardni postopki (angl. standard operating procedures) (Marty et al. 2006; Mir et al. 2006), kjer so glede na število tumorjev, njihovo velikost in lokacijo (na koži ali pod kožo) določeni tip elektrod, kemoterapevtik, anestezija in način dovajanja kemoterapevtika. Kemoterapevtik lahko dovedemo lokalno ali sistemsko. V elektrokemoterapiji oz. terapiji z električnimi pulzi sta najbolj razširjena kemoterapevtika cisplatin in bleomicin. Z elektrokemoterapijo je možno zdraviti tudi globlje ležeče tumorje (Miklavčič et al. 2010; Pavliha et al. 2013; Edhemović et al. 2014; Miklavčič in Davalos 2015). V zadnjem času se uveljavlja tudi uničevanje tumorskih celic z visokimi koncentracijami kalcija in električnimi pulzi (Frandsen et al. 2015; Frandsen et al. 2016; Frandsen et al. 2017). Pri elektrokemoterapiji se pojavijo še dodatni učinki, ki povišajo učinkovitost elektroporacije. Vazokonstrikcija zmanjša spiranje kemoterapevtika iz tumorja in s tem ohranja visoko koncentracijo kemoterapevtika v tumorju, obenem se zmanjša pretok krvi skozi tumor, kar povzroči hipoksijo in pomanjkanje hranilnih snovi (Mir 2006; Serša et al. 2008). Elektrokemoterapija sproži tudi odziv imunskega sistema, ki nato odstrani preostale tumorske celice (Serša et al. 2015). Z ireverzibilno elektroporacijo netermično odstranjujemo tumorje brez uporabe kemoterapevtika (Jiang et al. 2015a). Tako se popolnoma izognemo stranskim učinkom kemoterapevtikov, vendar na račun več dovedene energije in posledično Joulovega gretja. Pri ireverzibilni elektroporaciji dovajamo več (okoli 90) električnih pulzov, dolgih od 50 μs do 100 μs, s ponavljalno frekvenco 1 Hz. Dovedeno električno polje je v rangu nekaj kV/cm, kar je dosti več kot pri elektrokemoterapiji. Pri ireverzibilni elektroporaciji lahko z visoko natančnostjo odstranimo želeno tkivo – območje med uničenim in nepoškodovanim tkivom je široko le nekaj premerov celic (Rubinsky et al. 2007). Za odstranjevanje tumorjev tradicionalno uporabljamo termične metode (Hall et al. 2014) – radiofrekvenčno odstranjevanje in odstranjevanje s tekočim dušikom, kjer tkivo uničujemo z visoko oz. z nizko temperaturo. Prednost ireverzibilne elektroporacije pred uveljavljenimi termičnimi metodami je krajši čas zdravljenja, izognemo se učinkom hlajenja oz. gretja tkiva zaradi bližine žil (Golberg et al. 2015), pri čemer ostanejo okoliške pomembne strukture (žile, živci) nedotaknjene (Jiang et al. 2015a). Tudi pri ireverzibilni elektroporaciji je v dokončno odstranitev tumorskih celic vpleten imunski sistem (Neal et al. 2013). Pri elektrokemoterapiji in ireverzibilni elektroporaciji se zaradi daljših pulzov in ponavljalne frekvence 1 Hz pojavljajo težave zaradi krčenja mišic (Miklavčič et al. 2005), bolečine med dovajanjem pulzov, heterogenosti električnih lastnosti tkiv v tem frekvenčnem področju ter zaradi možnosti srčnih aritmij (Ball et al. 2010). Bolečini in krčenju mišic se lahko izognemo, če pulze dovajamo z višjo frekvenco, npr. 5 kHz (Županič et al. 2007; Serša et al. 2010). Srčnim aritmijam se izognemo tako, da s sinhroniziramo dovedene električne pulze z električno aktivnostjo srčne mišice (Mali et al. 2008; Deodhar et al. 2011a; Mali et al. 2015). Bolečini, krčenju mišic in heterogenosti električnih lastnosti tkiv se lahko izognemo z dovajanjem 1 μs bipolarnih pulzov (Arena et al. 2011; Arena in Davalos 2012; Sano et al. 2015). V zadnjem času so se pojavile tudi metode, s katerimi so vnos barvil v celico dosegli brezkontaktno s t. i. magnetoporacijo (Chen et al. 2010; Towhidi et al. 2012; Kardos in Rabussay 2012; Novickij et al. 2015; Kranjc et al. 2016; Novickij et al. 2017b; Novickij et al. 2017a). Elektroporacijo lahko uporabljamo ne le za zdravljenje tumorjev, temveč tudi za vnos učinkovin v kožo in skoznjo. Vnos učinkovin skozi kožo je neinvaziven, poleg tega pa se izognemo degradaciji učinkovin pri prehodu skozi prebavni trakt. Skozi kožo lahko preide le malo molekul, zato uporabljamo različne metode za povečanje prehoda učinkovin – iontoforezo, radiofrekvenčno mikroablacijo, laser, mikroigle, ultrazvok in elektroporacijo (Zorec et al. 2013b). Proces elektroporacije kože je slabo razumljen. Predpostavljamo, da pri dovajanju visokonapetostnih električnih pulzov v roženi plasti nastanejo lokalna transportna območja, kjer sta povišani električna prevodnost in prepustnost (Pliquett et al. 1996; Pliquett et al. 1998; Pliquett et al. 1998; Pavšelj in Miklavčič 2008a). Skozi lokalna transportna območja lahko nato učinkovine še nekaj ur po dovedenih pulzih vstopajo skozi kožo v krvni obtok (Zorec et al. 2013a). Gostota teh območij je odvisna od električnega polja v koži – višje električno polje jih povzroči več. Velikost lokalnih transportnih območij je odvisna od trajanja pulza. Med samim pulzom se zaradi Joulovega gretja topijo lipidi v roženi plasti, kar povzroči njihovo širjenje (Pliquett et al. 1996; Prausnitz et al. 1996; Pliquett et al. 1998; Weaver et al. 1999; Vanbever et al. 1999; Gowrishankar et al. 1999b). Načrtovanje posegov elektrokemoterapije in netermičnega odstranjevanja tkiva z ireverzibilno elektroporacijo Pri zdravljenju tumorjev z elektroporacijo lahko uporabimo standardne oblike in postavitve elektrod z že določenimi parametri električnih pulzov (Marty et al. 2006; Mir et al. 2006; Campana et al. 2014). Če zdravimo velike tumorje ali tumorje nepravilnih oblik, ki pogosto ležijo globlje, s standardno postavitvijo elektrod ne moremo zagotoviti ustrezne pokritosti tumorja z dovolj visokim električnim poljem. V tem primeru lahko elektrode med samim posegom večkrat premaknemo ali pa prilagodimo njihovo število in postavitev. Pri tem moramo prej pripraviti načrt posega (Kos et al. 2010; Miklavčič et al. 2010; Pavliha et al. 2012; Linnert et al. 2012; Edhemović et al. 2014). V njem zagotovimo, da bo cel tumor izpostavljen dovolj visokemu električnemu polju (Miklavčič et al. 2006a), obenem pa škoda na okoliškem tkivu minimalna. Načrtovanje posega poteka v več korakih: 1. zajem medicinskih slik (računalniška tomografija, magnetna resonanca) tumorja in okoliškega tkiva; 2. obdelava slik; 3. razgradnja slik in določitev geometrije tkiva; 4. vzpostavitev tridimenzionalnega modela; 5. optimizacija postavitve elektrod glede na obliko in velikost tumorja; 6. izdelava modela elektroporacije (izračun električnega polja in spremembe električne prevodnosti tkiva); 7. optimizacija napetosti med elektrodami in položaja elektrod (Pavliha et al. 2012). Na sliki 1 lahko vidimo izračunano električno polje v tumorju in okoliškem tkivu pri eni izmed možnih postavitev elektrod.

• Ključne besede: Elektroporacija, vzdražne celice, napovedni modeli, elektrokemoterapija, numerično modeliranje, ireverzibilna elektroporacija